199768. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3,5-dihidroxi-karbonsavak és származékaik, és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199768 B 2 való átállás után kolesztiraminnal (^R,Cuemid) indukáltunk. Szubsztrátumként (S,R)14C- HMG-CoA szolgált, a NADPH koncentrációt az inkubálás alatt egy regeneráló rendszerrel tartottuk fenn. A I4C-mevalonátot a szubsztrátumtól és más anyagoktól (például a 14C-HMG-tól) oszlopon történő eluálással választottuk el, úgy, hogy minden egyes mintának meghatároztuk az eluciós profilját. A 3H- mevalonát állandó együttvezetéséről lemondtunk, mivel a meghatározásnál a gátlóhatás relatív értékéről van szó. Egy kísérletsorozaton belül mindenkor együtt kezeltük az enzimmentes kontrollmintát, az enzimtartalmú normálmintát (=100%) és a készítményt is tartalmazó mintát. Az egyes értékeket három párhuzamos meghatározás középértékéből képeztük. A készítmény nélküli és a készítményt tartalmazó minták középértékei közötti eltérés szignifikáns voltát a t-teszttel ítéltük meg. Az ismertetett módszerrel a találmány szerint előállított vegyületekkel az alábbi HMG-CoA-reduktáz-gátló hatást állapítottuk meg: (ICso-érték (M) azt a moláris vegyületkoncentrációt jelenti, amely 50 %-os gátláshoz szükséges). Példaszám, amelyben a vegyületet előállítjuk ICso-érték (M) 11a 7,0 x 10'9 11c 2,0 x 10'8 lln 1,3 x 10'8 2) Koleszterin bioszintézis gátlás vizsgálata sejtkultúrákban, 14C-jelzett prekurzorok koleszterinbe való beépítésével. A módszerek elve: HEP G2 sejtekből álló monolayereket lipoproteinmentes táptalajon megfelelő koncentrációjú vizsgálandó anyagokkal 1 órán keresztül előinkubálunk; a 14C-jelzett prekurzor, 14C-nátrium- acetát hozzáadása után az inkubálást további 3 órán át folytatjuk. Ezután 3H-koleszterin belső standard előzetes hozzáadása mellett a sejtek egy részét lúgosán elszappanosítjuk. Az elszappanosított sejtekből a lipideket kloroform-metanol keverékkel extraháljuk. Ezt a lipidkeveréket hordozó-koleszterin hozzáadása után preparatív vékonyréteg-kromatográfiával elválasztjuk, jód-gőzzel történő előhívás után a koleszterin- sávokat elkülönítjük, és a 14C-prekurzorból képződött 14C- koleszterin-mennyiséget szcintigráfiás módszerrel meghatározzuk. A sejtek alikvot részében sejtfehérje-meghatározást végzünk úgy, hogy az 1 mg sejtfehérjére vonatkoztatott, egységnyi idő alatt a 14C-prekurzorból képződött 14C koleszterin-mennyiség számítható legyen. Egy hozzáadott vizsgálandó minta gátló hatásának összehasonlításához az oldószerkontrollt használtuk úgy, hogy közvetlenül azt a koleszterin-bioszintézis gátlást lehet megadni, amelyet a vizsgálandó készítmény egy bizonyos mólkoncentrációja a közegben kivált. A sejtkultúrák alikvot részeiben morfológiailag (fénymikroszkóppal) határoztuk meg a sejtkultúra intakt voltát és a készítmény hatása miatti hiányzó sejtkárosodást. A következő táblázatban megadjuk a mevinolinhoz viszonyított relatív hatáserősségeket (a mevinolint azonos módon teszteltük). Példaszám, amelyben a vegyület szerepel Mevinolinhoz viszonyított relatív hatáseiősség (%) 11a 100 11c 50 lln 30 Az alábbiakban példákkal is bemutatjuk a találmányt. 1. Példa Általános előírás a (XIII) általános képletü vegyületek előállítására 1 mól magnézium-forgácsot adunk 100 ml vízmentes éterhez, majd hozzáadunk 0,1 mól megfelelően helyettesített bróm-benzolt. Adott esetben a reakciót kevés jód, dibróm-etán hozzáadásával vagy melegítéssel indíthatjuk be. A reakció beindulása után cseppenként hozzáadjuk a maradék bróm-benzol 200 nil éterrel készített oldatát, oly módon, hogy az éter forrásban legyen. Az adagolás befejezése után további 1 órán keresztül refluxáltatjuk a reakcióelegyet. Ezután jégbe hűtjük, majd 0,9 mól megfelelően helyettesített R2-CHO aldehid 500 ml éterrel készített oldatát adjuk cseppenként a reakcióelegyhez. Ezután a hőmérsékletet hagyjuk szobahőmérsékletig felmelegedni, és további 1 órán keresztül kevertetjük az elegyet. Végül még két órán keresztül refluxáltatjuk. A reakcióelegyet ezután telített vizes ammónium-klorid oldatra öntjük. A vizes fázist kétszer éterrel extraháljuk, és az egyesített szerves fázisokat egy alkalommal telített vizes nátrium-hidrogén karbonát oldattal mossuk. Az oldatot magnézium-szulfáton szárítjuk, majd az oldószert vákuumban ledesztilláljuk. A (JÓII) általános képletű vegyületet szilárd anyag vagy olaj formában nyerjük ki, és adott esetben átkristályosítással vagy gyorskromatográfiásan tisztítjuk. A legtöbb esetben azonban a tisztítás nem szükséges. I. Táblázat (XIII) általános képletű vegyületek Példa Bróm-benzol Aldehid Termék száma la l-bróm-4-fluor-4-fluor-2-metil-(la) képletű-2-metil-benzol -benzaldehid vegyület lb l-bróm-4-fluor-3,5-dimetil-2-(lb) képletű-3-metil-benzol-metoxi-benzaldehid vegyület le l-bróm-4-fluor-2,4,6-trimetil(le) képletű-3-metil-benzol -benzaldehid vegyület ld l-bróm-4- fluor-4-fluor-3-metil-(ld) képletű-3-metil-benzol -benzaldehid vegyület 2. Példa Általános eljárás (X) általános képletü vegyületek előállítására 0,06 mól piridinium-klór-kromát (PCC) 200 ml 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
