199691. lajstromszámú szabadalom • Eljárás foszfatidil-inozit előállítására biológiai anyagokból
HU 199691 B A találmány tárgya eljárás lipidek előállítására, különösen foszfatidil-inozit előállítására, biológiai forrásból. A foszfatidil-inozit a foszfolipidek körébe tartozik, és biokémiai reagensként kerül felhasználásra olyan membránrendszerek előállításánál, amelyek az élő szervezet folyamatait modellezik; olyan liposzómák képzésére, amelyek fajidegen genetikai információknak az élő szervezet sejtjeibe való bevitelére szolgálnak; fajidegen fehérjéknek, vakcináknak és enzimeknek a szervezet membránhatárain való átvitelére; valamint gyógyszereknek és más hatóanyagoknak a célszervekbe való szállítására. Számos, különféle biológiai forrásokból, például állatok agyából és szívéből, baktériumokból vagy magvakból kiinduló eljárás ismeretes foszfatidil-inozit előállítására. Ismeretes egy olyan eljárás is, amelynél íoszfatidil-inozitot élesztőből állítanak elő („Preparativnaja khimija lipidov pod redukciejj Bergelsona L.D. i. Djatlovickojj E.V., 1981, Nauka (Moszkva), 178. old.", (A lipidek preparatív kémiája, szerkesztő: Bergelson, L.D. és Djatlovickaja E.V., Nauka (Moszkva), 1981.). A foszfatidil-inozitnak élesztőből való előállítása a következő műveletekből áll. Az élesztő toluolban 5 óra alatt autolizálják, az autolizátumból a foszfolipideket kloroform és metanol 1:1 arányú elegyével 7 órán belül extrahálják, az extraktumot'szűrik, a csapadékot az előzőekben megnevezett oldószereleggyel a szűrőn mossák, a szűrletet desztillált vízzel elegyítik 20 órán belül, a szűrletet vizes és kloroformos fázisra választják szét, a kloroformos fázist bepárolják, a bepárolt kloroformos fázist izopropil-alkohollal kezelik, majd üvegszűrőn szűrik. A továbbiakban a szűrletben lévő foszfolipideket szilikagél oszlopra viszik, az oszlopot először 5—7 liter 80:20:2 arányú kloroform:metanol:ammónia eleggyel, majd 1—2 liter etil-alkohollal mossák, majd az így kapott foszfatidil-inozit-ammóniumsót nátriumsóvá alakítják. Az ismertetett eljárás elvégzéséhez igen nagy mennyiségű, költséges szerves oldószer szükséges. így 1 g foszfatidil-inozit előállításához több mint 5 liter kloroform, több mint 3 liter metanol, mintegy 1 liter etil-alkohol és egyéb oldószerek szükségesek. Az eljárás több munkaigényes műveletből áll, amelyek igen időigényesek is. Mindez jelentősen megnöveli a végtermékre jutó költségeket (a Calbiochem 1986-os katalógusa szerint 1 g foszfatidil-inozit ára 6950 dollár). A nagy mennyiségű oldószerekkel végzett munka kedvezőtlen munkakörülményeket teremt, ami megnehezíti, hogy a dolgozóknak megfelelő körülményeket teremtsenek. A találmány célja olyan eljárás kidolgozása foszfatidil-inozit előállítására, amellyel lehetővé válik a szerves oldószer felhasználás jelentős csökkentése, a munka- és időigény csökkentése, a munkakörülmények javítása, és a termék árának jelentős csökkentése. 1 2 A célul kitűzött feladatot olyan eljárással valósítjuk meg, amelyben a foszfatidiP -inozit előállítására egy biológiai anyago* alkalmazunk, azt homogenizáljuk, és extraháljuk. A találmány szerint a biológiai anyag homogenizálását 0,005—1 mól/literes vizes sóoldattal végezzük, pH=5,0 és 11,0 között. A kapott .homogenizátumot sejtmentes vizes sóoldat-fázisra és csapadékra választjuk szét. A sejtmentes vizes sóoldat-fázis tartalmazza a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket, míg a csapadékban találhatók az egyéb foszfolipideket tartalmazó szét nem tört sejtek és részecskék. A csapadéknak a vizes fázistól való elválasztását 3000—30000 g közötti nehézségi gyorsulás mellett végzett centrifugálással, illetve 3—50 pm pórusátmérőjű szűrőn való szűréssel végezzük. Ezután a sejtmentes vizes sóoldat-fázisból elválasztjuk a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket, majd az elkülönített fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskékből extraháljuk a foszfatidil-inozitot. A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéknek a sejtmentes vizes sóoldat-fázisból való elválasztását végezhetjük gélkromatográfiás eljárással olyan szorbensen, amely képes az 1 000 000 dalton feletti molekulatömegű anyagok elválasztására, vagy alkalmazhatunk ultraszűrést olyan szűrő alkalmazásával, amelynek pórusátmérőí legalább 0,2 pm-esek. Megvalósíthatjuk a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex-részecskéknek az említett vizes sóoldat-fázisból való elkülönítését továbbá az oldatnak lúgos vagy neutrális proteázokkai való kezelésével, amely eljárásnál a megnevezett részecskék összetapadnak és könnyen elválaszthatóvá válnak. A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék elkülönítésének ezeket a változatait azért választottuk, mert egyszerűen megvalósíthatók, és niert az említett reagensek — proteázok — hozzáférhetőek és viszonylag olcsóak. Az elkülönített fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskékből a végterméket metanolos extrahálással, illetve metanol és kloroform elegyével végzett extrahálással vagy metanol és desztillált víz elegyével végzett extrahálással különítjük el. Biológiai anyagként célszerű a fűfélék magvainak feldolgozási termékét alkalmazni, mivel ez a nyersanyag különösen jól hozzáférhető és olcsó, továbbá a végtermék jó hozammal nyerhető belőle. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy a szerves oldószer felhasználást mintegy századrészére csökkentsük, az eljárás időszükségletét felére, negyedére rövidítsük, a „termék költségeit jelentősen csökkentsük és a munkakörülményeket javítjuk. Az eljárás könnyen megvalósítható nagyüzemi méretekben. A találmány szerinti eljárás előzőekben említett előnyeit a foszfatidil-inozit előállítását bemutató példák leírásánál mutatjuk be. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
