199630. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 11-deoxi-13,14-dihidro-15-keto-11b,16E-cikloprosztaglandin E2 tartalom radioimmunológiai meghatározására és az ehhez alkalmazott jód-125 izotóppal jelzett radioligandum előállítására
HU 199630 B hoz tartozó biciklo-PGEM koncentrációkat kiszámítjuk. A mérést úgy végezzük, hogy a tracert, a hígítási sorozat szerint különböző mennyiségű inaktív biciklo-PGEM-t, illetve mérendő mintát, specifikus antitesttel inkubáljuk, majd az antitesthez kötött, ill. nem kötött frakciókat elválasztjuk, és mérjük a kötött frakció radioaktivitását. Általában 10000 és 60000, előnyösen 20000 és 40000 cpm közötti beütésszámú tracert alkalmazunk, amelyet célszerűen pufferben oldunk. A puffer előnyösen 0,1 % zselatint tartalmazó 0,01—0,2 mólos célszerűen 0,05 mólos, 7,4 pH-jú foszfát-puffer. Az oldat konkrét összetételétől függően az inkubációs hőmérséklet 0 és 40°C közötti, az inkubáció időtartama 1 és 40, előnyösen 3 és 20 óra között változik. A specifikus antitest célszerűen magas titerű, megfelelően magas (109—10‘°M) affinitási együtthatóval rendelkező anti-biciklo-PGEM antiplazma, amelyből annyit alkalmazunk, amennyi az inaktív biciklo-PGEM-t nem tartalmazó mintában a tracer 20—80, előnyösen kb. 50%-át képes megkötni. A radioligand kötött és szabad frakcióinak elválasztására előnyösen 0,5 % Dextran T-70- -et és 1 % csontszenet tartalmazó 0,01 mólos foszfát-puffért (pH 7,4) alkalmazunk, amely a szabad radioligandumot megköti, és a centrifugálással kapott felülúszó tartalmazza az antitesthez kötött tracert, melynek radioaktivitását szcíntil lációs módszerrel mérjük. A radioimmun meghatározás előtt a minták illetve a standard oldatok PGEM tartalmának biciklo-PGEM-mé történő alakítása a korábban hivatkozott források szerint általánosan alkalmazott módszer szerint történik 9-es pH-értéken, 37°C-on végzett 24 órás reakcióidővel. A találmány tárgya továbbá eljárás a radioimmun meghatározáshoz szükséges (I) képletű, nagy fajlagos aktivitású, jód-125 izotóppal jelzett biciklo-PGEM- jódtirozinmetilészter (biciklo-PGEM-TME-125I) előállítására. A találmány szerint az (I) képletű radioligandot úgy állítjuk elő, hogy a (II) képletű biciklo-PGEM-TME származékot előnyösen nagy fajlagos aktivitású, (kb. 2000 Ci/mmol; 74 TBq/mmol) Na125I-dal reagáltatjuk célszerűen Klóramin-T (para-toluol-szulfoklóraminnátriumsó) reagens jelenlétében pufferolt közegben (előnyösen 7 fölötti pH értéken) rövid (10—200 másodperc), előnyösen 30— 60 másodperc reakcióidővel, úgy, hogy a (II) képletű biciklo-PGEM származékot a NA125I-hoz képest 20—200, előnyösen 50X 100-szoros mólarányban alkalmazzuk, és a reakcióidőt úgy szabályozzuk, hogy megfelelő időpontban a rendszerben Klóramin-T hatására képződő reakcióképes oxidált jódot nátrium-metabiszulfit hozzáadásával jodid-ionná redukáljuk. Az (I) képletű célvegyület szintéziséhez 3 célszerűen foszfát puffert alkalmazunk, a (II) képletű anyagot pedig etilalkoholos oldatban adjuk a reakcióelegyhez oly módon, hogy az etanol végkoncentrációja a 20 %-ot ne haladja meg. Az (I) képletű célvegyület előállításának legfontosabb lépése az előállítani kívánt monojód-származék elválasztása az egyéb jódjelzett származékoktól, valamint a reakció befejeződése után még gyakorlatilag változatlanul nagy feleslegben levő (II) képletű inaktív kiindulási anyagtól. Erre célszerűen adszorpciós oszlopkromatográfiát alkalmazunk, melyet úgy végzünk, hogy a reakcióelegyet Sephadex LH-20 oszlopra felvisszük és növekvő etanol koncentrációjú etanol-nátriumcitrát (pH 4,0) kétkomponensű oldószereleggyel eluáljuk a különböző jódjelzett származékokat, miközben az eluens radioaktivitását folyamatosan mérjük, és az ezzel arányos jelet a megfelelő regisztráló készülékkel rögzítjük. Az eluáló oldószerelegyek változtatásának találmány szerinti célszerű sorrendje: tiszta citrát-puffer (0,2 mólos pH 4,0); 1 mólos citrát (pH 4,0) és etanol 4:1, végül 1 mólos citrát (pH 4,0) és etanol 6:4 arányú elegye, ahol a tiszta végterméket az utolsó frakcióban kapjuk meg. Az oldószerelegyek szükséges térfogata az aktuális, és az elválasztás közben folyamatosan regisztrált elúciós profil és a képződött jelzett vegyü letek összetételének (arányának) függvénye, általában a tiszta citrát-pufferből 40—70 ml-t, a 4:1 arányú citrát:etanol elegyből 20—40 ml-t, míg a 6:4 arányú elegyből 30—60 ml-t alkalmazunk. Külön előnye a találmány szerinti eljárásnak, hogy az alkalmazott apoláros dextrán gél ebben az eljárásban kizárólag adszorbensként működik, és a jódjelzett származékok adszorpciós készsége nagyságrendekkel magasabb a kiindulási (II) képletű inaktív anyagnál, ily módon az (I) képletű célvegyület—, amelyet még hatásos jódbeépülés mellett is jelentős mennyiségű (II) képletű kiindulási anyag szennyez — teljes biztonsággal választható el, és ezzel a találmány szerinti radioimmun meghatározáshoz szükséges magas fajlagos aktivitás biztosítható. A (II) képletű vegyületet a (III) képletű biciklo-PGEM és tirozin-metilészter reakciójával állítjuk elő oly módon, hogy a biciklo-PGEM-et 1—5, előnyösen 2—3 mólarányú tirozin-metilészterrel reagáltatjuk, 1—5, előnyösen 2—3 mólarányú I-éti 1-3-(3’-dimeti 1- -aminopropil) -karbodiimid-hidroklorid reagens jelenlétében, célszerűen vizes tetrahidrofuránban, 0—50°C-on,,előnyösen szobahőmérsékleten, 3—40, előnyösen 20—24 óra időtartamig. Az oldószert vákuumdesztillációval eltávolítjuk, a maradékot célszerűen etil-acetátban oldjuk, majd az etil-acetátos oldatból híg savas extrakcióval, célszerűen 0,1 n sósavval kimossuk a változatlan tirozin-metilésztert, híg lúgos, célszerűen 0,1 n NaOH-dal extrakcióval pedig az el nem reagált (III) képletű vegyületet. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
