199630. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 11-deoxi-13,14-dihidro-15-keto-11b,16E-cikloprosztaglandin E2 tartalom radioimmunológiai meghatározására és az ehhez alkalmazott jód-125 izotóppal jelzett radioligandum előállítására
HU 199630 B A terméket célszerűen vékonyréteg-kromatográfiás úton tisztítjuk, célszerűen olyan szilikagél rétegen, amely fluoreszcens indikátort tartalmaz, a kifejlesztő oldószerelegy pedig célszerűen kloroform;metanol:víz 90:10:1 térforgatarányú elegye. A terméket 254 nm-es UV-fénnyel megvilágítva mutatjuk ki. A találmányt a továbbiakban részletesebben példák keretében magyarázzuk, amelyekre a találmány természetesen nem korlátozódik. 1. Példa A jódjelzéshez használt (II) képletű köztitermék előállítása 1 mg (3 mikromol) (III) képletű biciklo-PGEM-et, 1,5 mg (8,4 mikromól) 1 -etil-3-(3’-dimetil-aminopropil)-karbodiimid-HCl-ot és 2 mg (10 mikromól) tirozin-metilésztert egyszerre bemérünk, hozzáadunk 100 mikroliter desztillált tetrahidrofuránt és 20 mikroliter desztillált vizet. Az elegyet szobahőfokon 24 órán át kevertetjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a maradékot 30 ml etil-acetátban feloldjuk, és rázótölcsérbe öntjük. Ezt az oldatot sorrendben 3X2 ml 0,1 n sósavval, 3X2 ml vízzel, 3X2 ml 0,1 n nátriumhidroxiddal és 3X3 ml vízzel összerázzuk. Minden összerázás után a vizes fázist elválasztjuk és elöntjük. Az utolsó mosás után az etil-acetátos oldatot forgóbepárló készüléken (Büchi, svájci gyártmány) vákuumban bepároljuk, a maradékot 100 mikroliter etil-alkoholban oldjuk, és 0.25X200X X100 mm méretű Kieselgel 60 F 254 (Merck, NSZK gyártmány) szilikagél rétegre 5 cm széles sávban felvisszük, és benzol:dioxán: :ecetsav:hangyasav 82:14:1:1 térfogatarányú elegybe helyezve, a kromatogramot kifejlesztjük. Kifejlesztés után a réteget hideg levegővel szárítjuk, majd 254 nm hullámhosszú ultraibolya fénnyel megvilágítva a foltokat láthatóvá tesszük. A 0,4 Rf értékű folt helyén a réteget lekaparjuk, 10 ml éti 1- -alkoholt teszünk rá, és 1 óra várakozás után üvegszürőn szűrjük. A szűrőn levő gélt 2X X5 ml etil-alkohollal mossuk, az alkoholos oldatokat egyesítjük, forgóbepárlón szárazra, pároljuk, és mérjük a termék súlyát, majd etil-alkohollal törzsoldatot készítünk belőle. A kapott (II) képletű termék tömege a kromatográfiás tisztítás után 590 mikrogramm, ami 38,5 % kitermelésnek felel meg. 2. Példa Az (I) képletű céltermék előállítása Az 1. példa szerint kapott biciklo-PGEM-TME származék 100 mikrogramm/ml koncentrációjú etanojos oldatából 30 mikrolitert (6,5nmol) 1 ml-es talpas műanyag Eppendorf-csőbe pipettázunk, hozzáadunk 100 mikroliter 50 mM foszfát puffert (pH 7,4) és 57 MBq radioaktivitású hordozómentes Na l25I-oldatot (MTA Izotópkutató Intézete terméke). Az ele-5 4 gyet összerázzuk, majd 50 mikroliter, 7 mg/ml koncentrációjú nátrium-metabiszulfit oldatot pipettába előre felszívunk a reakció leállításához. Az elegyhez ezután hozzápipettázunk 25 mikroliter 4,8 mg/ml koncentrációjú klóramin-T reagens oldatot, az elegyet összerázzuk és pontosan 60 másodperc múlva az előre elkészített nátrium-metabiszulfit oldat hozzáadásával a reakciót befagyasztjuk. Az elegyet ezután oszlopkromatográfiás módszerrel választjuk el a következőképpen: Sephadex LH-20 (Pharmacia, Svéd gyártmány) gélt desztillált vízben 24 órát duzzasztunk, majd 20X1 cm méretű, alul elvezető, felül bevezető polietilén csővel ellátott üvegcsőbe töltjük, alkalmas oldószeradagoló perisztaltikus pumpával (LKB, Svéd gyártmány) összekapcsoljuk, mintegy 10 percig egyensúlyba hozzuk 0,2 mólos citromsavval (pH 4) mintegy 0,5 ml/min áramlási sebességgel. Az így előkészített hordozóra a reakcióelegyet felvisszük, és az elúciót az előző oldószerrel folytatjuk. Az eluens radioaktivitását folyamatosan detektáljuk oly módon, hogy az oszlop elvezető csövét ólommal árnyékolt, NaI (TI) szcintillációs kristály (Gamma gyártmány) előtt vezetjük el, a kristályt pedig számláló berendezéssel (scaler, Gamma gyártmány) és vonalíróval (Gamma gyártmány) kötjük össze. Az eluenst mérőhengerbe gyűjtjük, az első eluensből 50 ml-t alkalmazunk, majd 1 mólos citromsav (pH 4) és etil-alkohol 4:1 arányú elegyével folytatjuk, végül az etanol arányát 6:4-re emeljük. A kívánt termék gyűjtését a detektáló készülékben megjelenő csúcs szerint végezzük, a radioimmun meghatározáshoz a csúcs közepének megfelelő mintegy 5 ml-es frakciót választjuk külön. Ennek radioaktivitása 10,2 MBq, ami 17,9% radioaktív hozamnak felel meg. A hozam természetesen az elérhetőnél lényegesen alacsonyabb, mivel a terméknek csak egy része kerül gyűjtésre. 6 3. Példa Vérplazma 13,14-dihidro-15-keto-PGE2 koncentrációjának radioimmun meghatározása nyúl vénás véréből 7,5 ng/ml koncentrációjú biciklo-PGEM törzsoldatból izotóniás sóoldatban hígítási sorozatot készítünk úgy, hogy 1 — 1 ml térfogatú oldatmintákat kapjunk, melyek hatóanyagkoncentrációja 6—19—56—167—500 pg/ml. A vérplazma mintákat izotóniás sóoldattal tízszeresére hígítjuk, és ezekből is 1 — 1 ml térfogatú mintákat készítünk. A standard-, illetve mintaoldatokhoz, valamint 1 ml izotóniás sóoldathoz („0“ standard) hozzáadunk 40 mikroliter 1 mólos Na2C03 oldatot, a csöveket kémcsőkeverővei néhány másodpercig keverjük, lezárjuk, és 37°C-on tartjuk 20— 24 óráig. Ezután a fenti oldatokhoz 60 mikroliter 1 mólos káliumdihidrogén-foszfát olda-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
