199630. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 11-deoxi-13,14-dihidro-15-keto-11b,16E-cikloprosztaglandin E2 tartalom radioimmunológiai meghatározására és az ehhez alkalmazott jód-125 izotóppal jelzett radioligandum előállítására
HU 199630 B A találmány tárgya eljárás a prosztaglandin E2 bomlékony biológiai metabolitja, a 13,14-dihidro-15-keto-prosztaglandin E2 (továbbiakban: PGEM) radioimmunológiai meghatározására annak kémiai átalakítással stabilizált származékán, a 1 l-deoxi-13,14-dihidro-15-keto-l lB,16E-ciklo-prosztaglandin E2-n (továbbiakban: biciklo-PGEM) keresztül, melynek során ismert mennyiségű, különböző koncentrációjú PGEM oldatokban, illetve a mérendő mintákban a PGEM-et biciklo-PGEM-mé alakítjuk, majd jód-125 izotóppal jelzett, nagy fajlagos aktivitású biciklo-PGEM származék mint nyomjelző anyag (továbbiakban: radioligandum vagy tracer) specifikus antitesthez való kötődésének változását mérjük a standard oldatok és a meghatározandó minták jelenlétében, és a minták által okozott kötésváltozás alapján számítjuk azok hatóanyagtartalmát. A találmány szerint ebben az immunokémiai reakcióban tracerként olyan, egyes prosztaglandin típusokra már korábban sikerrel alkalmazott radioligandokkal analóg szerkezetű, származékot használunk, mely a találmány tárgyát képező prosztaglandin típusra még nem ismert. A találmány tárgya továbbá ezen új szerkezetű radioligand előállítására szolgáló eljárás. A különböző kémiai szerkezetű prosztaglandinok egyik legfontosabb képviselője a prosztaglandin E2 (PGE2). Mivel ez az anyag — a többi prosztaglandinhoz hasonlóan — enzimatikus úton igen gyorsan metabolizálódik, PGEM-mé alakul át, a PGE2 élettani koncentrációjának mérése a PGEM koncentráció meghatározásával célszerű. Maga a PGEM azonban szintén bomlékony vegyület; kémiai úton, vízvesztéssel és intramolekuláris Michael addícióval biciklo-PGEM-mé alakul át. (Prostaglandins 19:917,1980; Prostaglandins 19:933, 1980) A jellemző átalakításokat az A folyamatábra szemlélteti. Mivel ez az átalakulás önmagában nem teljes, és a minta feldolgozási körülményeitől függően változhat, ezért olyan reakciókörülményeket kell választani, amely mellett a PGEM kvantitatíve biciklo-PGEM-mé alakul át. Az így kapott stabilis származék már radioimmun meghatározásra alkalmas. Az igen alacsony élettani koncentrációk miatt a radioimmun módszer szinte kizárólagos érvényű. Erre az eddigi források kizárólag tricium izotóppal jelzett tracert alkalmaztak. (Meth. Enzymol. 86:306,1982; J. Pharmacol. Exp. Ther. 220:229,1982; Prosta. Leuk. Med. 9:549,1982; J. Clin. Endocrinol. Metab. 57:101,1983; Prosta. Leuk. Med. 13:249, 1984; Biol. Psychiatry 21:1024,1986.) A triciummal jelzett tracer elvi előnye, hogy e módszernél a radioligandum és az inaktív ligandum kémiailag azonos molekulák (ún. „homológ radioimmunoassay“). További előnye, hogy a módszerhez szükséges megfe1 2 lelően nagy fajlagos aktivitás biztosítható, ugyanakkor az alkalmazott izotóp felezési ideje nem túl rövid. Más prosztaglandin típusok esetében a triciummal jelzett tracer helyett sikerrel alkalmaznak olyan radioligandumokat, amelyek prosztaglandin alapmolekulához kötött funkciós csoporton jód-125 izotópot tartalmaznak. (Eur. J. Clin. Invest. 5:311,1975; Biochim. Biophys. Acta 431:139,1976; Anal. Biochem. 87:343,1978; Prosta. Med. 4:399,1980; Prostaglandins 16:277,1978; Adv. Prosta. Thromb. Res. 6:167,1980; Izotóptechnika, 22:190,1979; J. Chromatography 189:433,1980 Mucha István: Kandidátusi értekezés 1985.) A jód-125 jelzett tracer előnye a triciummal jelzetthez képest, hogy fajlagos aktivitása annak mintegy tízszerese, és ezáltal a meghatározás érzékenysége jelentősen növelhető, felhasználása ugyanakkor gazdaságos is, mivel méréstechnikája gyorsabb, egyszerűbb, és olcsóbb, és a radioimmun meghatározáshoz szükséges specifikus antitest igénye is lényegesen kevesebb. Alkalmazásának egyik lehetséges hátránya elvi jellegű; mivel ezen meghatározási módszernél a radioligandum és az inaktív ligandum kémiailag különböznek (ún. „heterológ radioimmunoassay“), a nagyobb fajlagos aktivitás csak abban az esetben párosul érzékenység-növekedéssel, ha a radioligandum immunspecifitása a kémiai átalakítás után is változatlan marad. A jód-125 izotóppal jelzett tracer felhasználásának gyakorlati hátránya, hogy az izotóp felezési ideje rövid, és a vele való műveletek sugárveszélye nagyobb a triciuménál. A találmány alapja az a felismerés, hogy egyéb kismolekulájú anyagokkal-, így különböző prosztaglandinokkal is — analóg módon, a biciklo-PGEM radioimmun meghatározása is lehetséges jód-125 izotóp felhasználásával, ha az alapmolekulához tirozin-metilészter csoportot kapcsolunk, és ezt mint prosztetikus csoportot jód-125 izotóppal szelektíven jelöljük. Az eljárás feltétele, hogy rendelkezzünk a módszerhez szükséges alkalmas titerü, biciklo-PGEM-re és annak jód-125-tel jelzett származékára azonos affinitású specifikus antitesttel, valamint a megfelelő nagy fajlagos aktivitású jód- 125-tel jelzett tracerrel. A találmány tárgya tehát antigén-antitest reakciós meghatározás, mely az ismert eljárásoktól abban különbözik, hogy triciummal jelzett tracer („homológ“ radioligand) helyett jód-125-tei jelzett tracert (heterológ“ tracer) alkalmazunk. Ennek során úgy járunk el, hogy ismert mennyiségű különböző koncentrációjú PGEM standard oldatokat, valamint a mérendő mintákat azonos módon lúgos pH-n biciklo-PGEM-mé alakítjuk, majd a radioligandnak specifikus antitesthez való kötődését mérjük ezek jelenlétében. Az így kapott értékekből az ismeretlen minták által okozott kötésváltozások2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
