199562. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás glükóz izomerizálására
don, hogy ilyeneket tartalmazzon — bifunkciós aminok is alkalmazhatók térhálósítószerként a találmány szerinti eljárásban. Ezek lehetnek például legfeljebb 12 szénatomot tartartalmazó diaminok, például fenilén-diamin, butilén-diamin, oktilén-diamin, pentilén-diamin, etilén-diamin vagy dodecilén-diamin. A térhálósítószer mennyisége széles határok között változhat: az enzim és a térhálósítószer aránya körülbelül 0,1-től körülbelül 0,0001-ig terjedhet. A szükséges kötés kialakításának módját bizonyos mértékig meghatározza' a választott térhálósítószer és az enzim minősége. A reagenseket általában valamely inert oldószerben oldjuk, és a reakciót célszerűen alacsony hőmérsékleten hajtjuk végre, hogy elkerüljük az esetleg hőérzékeny enzimre gyakorolt káros hatásokat. Általában előnyösek a szobahőmérsékleten vagy annak közelében lejátszódó reakciók, reakcióközegként pedig vizet vagy víztartalmú oldószereket alkalmazunk. Amellett, hogy az enzimmolekulára polimerizálható vinilcsoportokat szubsztituálunk, majd a fent leírt módszerekkel polimerizáljuk, a molekula stabilizálásának egy másik módszere abból áll, hogy. valamely előre kialakított (preformált) polimert kondenzálunk az izomerázzal, intermolekuláris kovalens kötések kialakítása útján. Az enzim stabilizálását biztosító peptidkötések kialakításához az izomerázt például polipeptidekkel — mint például a természetben előforduló fehérjék vagy azok hidrolízistermékei — reagáltathatjuk az ismert módszerek alkalmazásával. Az így előállított termékek lehetnek vízoldhatók, de térhálósítószerekkel, például glutáraldehiddel vízben oldhatatlanná tehetjük őket, s az így kapott térhálósított enzimrendszer általában még stabilabb. A peptidképző reakciókat ismert módszerekkel, például karbodiimidek alkalmazásával hajtjuk végre. Kívánt esetben az eredeti enzim átalakítható az előzetesen előállított (preformált) molekulával való kondenzálás céljára oly módon, hogy az ehhez szükséges funkciós csoportot bevisszük az enzimmolekulába. Például karboxicsoportot úgy vihetünk be egy szabad aminocsoportot tartalmazó enzimbe, hogy azt valamely dikarbonsavval reagáltatjuk, s így karboxicsoportot tartalmazó enzimmé alakítjuk át. A fenti módszerhez előre kialakított polimerként felhasználhatunk bármely olyan polimert, mely az elvégzendő reakcióhoz megfelelő mennyiségű és minőségű funkciós csoportot — például amino- vagy karboxicsoportot — tartalmaz. Előnyösen alkalmazhatók a polipeptidek, például a természetes fehérjék — mint például citozán, élesztő-fehérje, stb. — valamint ezek keverékei, továbbá az aminocsoportot tartalmazó polimerek, például a polietilén-imin. Az előnyösen alkalmazható előre kialakított polimerek rendszerint vízoldható termékeket képeznek, ezeket előnyösen oldhatatlanná alakítjuk át oly 13 8 módon, hogy .például glutáraldehiddel vagy a fent leírt egyéb térhálósítószerek valamelyikével reagáltatjuk. Az enzim módosítására fent leírt módszerek mindegyikében alapvetően fontos, hogy biztosítsuk a megfelelő eredmény eléréséhez szükséges mennyiségű funkciós csoport — például amno- vagy karboxicsoport — jelenlétét. Mikor kiválasztjuk az előre kialakítandó polimert, melyet az enzimmel reagáltatni fogunk, szükséges, hogy az tartalmazzon olyan csoportokat, melyek az enzimmolekulában található csoportokkal reakcióba lépnek. Ha például az enzimre szabad aminocsoportok találhatók, akkor olyan proteint választunk, mely szabad karboxicsoportokat tartalmaz. Továbbá a választott reagensek sok reakcióképes csoportot kell tartalmaznia, hogy az enzimmolekulához több ponton kapcsolódva jelentős mértékben növelje a stabilitást. A technikában jól ismertek a különböző reagensek reakcióképes csoportjainak mennyiségi és minőségi meghatározására szolgáló módszerek. Még egy módszert említünk az enzim hőstabilitásának növelésére, mely abból áll, hogy a felületet kémiailag megváltoztatjuk az aktivitás észlelhető csökkenése nélkül. Például a felületi aminocsoportok amidinezésével (Ludwig, M.L. és Hunter, M.J. Meth. Enymol. II, 595—604 (1967)) vagy guanidinezésével (Kimmel, J.R., Meth. Enzymol. 11, 584—589 (1967) ) az arginihez nagyon hasonló szubsztituenseket állíthatunk elő. Tej-dehidrogenáz és más fehérjék stabilizálásának leírása megtalálható az alábbi közleményekben: Tuengler, F. és Pfleiderer, G., Biochem Biophys. Act a, 284, 1—8 (1977); Minotani, N. és munkatársai Biochim. Biophys. Acta, 581, 334—341 (1979); valamint Cupo, P. és munkatársai, J. Biol. Chem., 225,10828—10833 (1980). Az oldható izomeráz készítmény aktivitását a Lloyd és munkatársai (Cereal Chemistry, 49, No, 5, pp. 544—553 (1972)) által leírt módszer alapján határoztuk meg. Egy IGIU az izomeráznak az a mennyisége, mely pH=6,85-ön (0,2 M nátrium-maleát), 60°C-on, percenként 1 mikromól glükózt alakít át fruktózzá egy olyan oldatban, mely literenként 2 mól glükózt, 0,02 mól magnézium-szulfátot és 0,001 mól kobalt-kloridot tartalmaz. Az alábbi példák a találmány szerinti eljárás illusztrálására szolgálnak. 1. Példa Ez a példa egy glükóztartalmú oldat — lényegében kukoricakeményítő-hidrolizátum — közvetlen izomerizálását mutatja be, melyben kétfázisú izomerizációs eljárást alkalmazunk szárazanyagra számítva 55,5 t% fruktózt tartalmazó készítmény előállítása céljából. Először alacsony hőmérsékletű izomerizálást hajtunk végre 70°C-on, majd a reakció terméket bevezetjük egy második, magas hő-14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
