199562. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás glükóz izomerizálására
HU 199562 B 16 15 mérsékletű reaktorba (105,2°C), mely kémiailag stabilizált izomerázt tartalmaz. Az izomerázt úgy stabilizáljuk, hogy kovalens kötéssel egy oldható polimerhez kapcsoljuk, majd oldhatatlanná alakítjuk, hogy rögzített katalizátort kapjuk. A hidrolizátumot kukoricakeményítőből állítjuk elő a 3,644,126 és a 3,280,006 számú, egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint (elfolyósítás illetve elcukrosítás). Az elcukrosított folyadékot a 3,834,940 számú, egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint finomítva, szárazanyagra számítva 95,3 t% glükóztartalmú terméket kapunk. Ehhez annyi kristályos glükózt adunk, hogy a glükóztartalom szárazanyagra számítva 97,6 t%-ra növekedjék. így az alábbi összetételű oldatot kapjuk: összes szárazanyag (t%) Glükóz (t%, szárazanyagra) Fruktóz (t% szárazanyagra) Poliszacharid (t% szárazanyagra) Pszikóz (t% szárazanyagra) Nátrium-hidrogénszulfát (mM) Magnézium-szulfát (mM) Kobalt-klorid (mM) pH Az alacsony hőmérsékletű izomerizálásí 70°-on végezzük oly módon, hogy a fenti tápoldatot 3,2 ml/perc sebességgel vezetjük át az alacsony hőmérsékletű reaktoron. Az alacsony hőmérsékletű (70°C-os) izomeráz-reaktort úgy állítjuk össze, hogy egy 2,5 cm átmérőjű, be- és kivezető nyílással, valamint a termosztátból jövő víz cirkuláltatására szolgáló köpennyel felszerelt üvegcsövet megtöltünk DEAE-cellulózon megkötött izomerázzal, melyet a 3,788,945 számú, egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint állítunk élő. 50,2 97,6 0,0 2,4 0,0 50,0 5,0 0,1 6,8 A töltés feletti üreg egy hőmérőt tartalmaz, ezen kívül pedig — amennyiben ez célszerű — üveggyönggyel töltjük ki, hogy a holtteret minimálisra csökkentsük. A reaktor 20 000 IGIU-nak megfelelő kötött izomerázt tartalmaz, a töltet 15 cm hosszúságú. A reaktorból távozó első 1 000 ml-t elöntjük. Az ezután távozó folyadékot összegyűjtjük a második, magas hőmérsékletű izomerizálásí szakaszhoz. A magas hőmérsékletű reaktorhoz a kémiailag stabilizált katalizátort a következőképpen állítjuk elő: Egy, az S. rubigenosus ATCC 21175-ből származó Streptomyces rubigenosus fajt tenyésztünk víz alatti aerob fermentálással, az alábbi táptalajon: dextróz kukorica-csávalé diammónium-foszfát magnézium-szulfát töme^% 1,6 (szárazanyag) 0,08 0,06 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 habzásgátló (Pluronic PL-61) 0,003 A közeget 121°C-on 45 percig sterilizáljuk, majd lehűtjük, és a pH-ját 6,8—7,0-re állítjuk be. Ezután beoltjuk egy 14 térfogatszázalékos oltóanyaggal, melyet a fent említett S. rubigenous változatból oltóanyag-fermentorban állítottunk elő. Az erjesztést aszeptikus körülmények között 30°C-on, körülbelül 60 órán át vé!gezük 0,65 térf/térf/perc szellőztetéssel. Az S. rubigenosust felhasználhatjuk oltásra és izomeráz előállítására is, ez esetben az alábbi összetételű közeget alkalmazzuk: tömeg% dextróz kukorica-csávalé szorbitol kobalt-klorid diammónium-foszfát xilóz 0,24 1,5 (szárazanyag) 1,6 0,02 0,56 1,0 A glükóz-izomerázt úgy extraháljuk az S. rubigenosusból, hogy 0,35 t% . Maquat MC 1412 jelű kationos felületaktív-szert (Mason Chemical Co.) és 10 ppm tyúktojás-lizozim enzimet adunk hozzá, majd 5 órán át, 40°C-on, pH=6,3—6,6-os értéken keverjük. A keveréket leszűrve megkapjuk a nyers, tisztítatlan izomeráz enzimet. A nyers izomerázt úgy tisztítjuk, hogy (a 3,823,133 számú, egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint előállított) DEAE-cellulózon adszorbeáljuk, leszűrjük, a szennyezések eltávolítása céljából 0,1 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk, majd 0,45 mólos nátrium-klorid-oldattal deszorbeáljuk. A tisztítási lépések során minden oldat pH-ját 7,5-es értéken tartjuk. Az így kapott, részlegesen megtisztított izomeráz-oldatot 0°C-on 3 térfogatrésznyi 95 t%-os etanollal kezeljük, így kicsapódik az izomeráz. A szűrés elősegítésére perlitet adunk hozzá, a szilárd anyagot szűréssel és levegőn történő szárítással nyerjük ki, így megkapjuk a vízoldható izomeráz-készítményt, mely 2500 IGIU/g hatóanyagot tartalmaz. A tisztított izomerázt 1 mM töménységű mangán-klorid-oldatban, szobahőmérsékleten feloldva 10 mg/ml izomerázt tartalmazó oldatot kapunk, majd ezt a szűrési segédanyag eltávolítása céljából leszűrjük. A készítmény specifikus hatóanyag-koncentrációja 37,3 IGIU/mg protein. Az oldható poliamin oldatát úgy kapjuk, hogy 39,0 g citozánt (Kytex, a Hercules Inc. cégtől, Wilmington, Delaware 19899) 13 liter 0,08 N sósavban olcfunk. A citozán feloldása után az oldatot 380 g nátrium-klorid hozzáadásával nátrium-kloridra nézve 0,5 mólossá tesszük, majd 8 N nátrium-hidroxiddal beállítjuk a pH-ját 6,15-re. Végül a citozánoldatot Whatman 3-as szűrőpapíron leszűrjük a nem oldódó anyagok eltávolítása céljából. 9
