199562. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás glükóz izomerizálására
HU 199562 B ‘ti elemeket viszünk be az enzimmoiekulába, melyek azt a normál denaturálási hőmérséklet fölé melegítve is ellenálóvá teszik a lebomlással szemben. Ennek egyik előnyös módszere, hogy kémiai szubsztitúcióval polimerizálható vinilcsoportokat tartalmazó molekularészeket visszük be az enzimbe, úgy, hogy ezek több ponton szilárdan kötődjenek az enzim felületéhez. Ezután az enzimet egy vagy több polimerizálható vinilvegyület vizes oldatával keverjük' és a keveréket kopolimerizáljuk, hogy kémiailag stabilizált enzim képződjék, .ahol az enzim több ponton szilárdan kötődik egy háromdimenziós polimer-mátrixhoz, mely az enzimhez képest kiegészítő (komplementer) alakot vesz fel. Ilyen típusú stabilizálásra példák találhatók a következő helyeken: Martinék és munkatársai (Biochem. Biophys. Acta 485, 1 — 12 (1977)), valamint Kulys és munkatársai (Biokhimiya, 42, No. 3. 453—59 (1978)). A fenti reakciók végrehajtásakor alapvetően fontos, hogy elkerüljük az olyan körülményeket, melyek az izomeráz denaturálásához, s ezáltal aktivitásának csökkentéséhez vezethetnek. Például a fenti reakció minden egyes lépésében kerülni kell a szélsőséges pH-értékeket és hőmérsékleteket. Többek között az alábi reagenseket használhatjuk arra, hogy polimerizálható vinilcsoportok bevitelével módosítsuk az izomeráz enzimet: akriloil-klorid, metakriloil-klorid, akrolein, krotonaldehid, maleinsavanhidrid, 3,4-epoxi-butén, akrilsav-2,3-epoxi-propilészter, akrilsav-2,3-tioglicidilészter, l-alliloxi-3- -(N-eti!énimin)-2-propanol, akrilsav-O-szukcinamidészter, klór-maleinsavanhidrid, maleinsavazid, 3-bróm-propén, allil-izocianát. Ezek a vegyületek reagálni tudnak az izomeráz szabad aminocsoportjaival, például a lizinrészek epszilon-amino-csoportjáival. Az izomeráznak könnyen polimerizálható vinilcsoportokkal történő szubsztituálására egyéb olyan vegyületeket is alkalmazhatunk, melyek az izomeráz szabad karboxilcsoportjaival reakcióba tudnak lépni. Példák olyan vinilvegyületekre, melyek a módosított izomerázzal kopolimerizálhatók: nátrium-akrilát, nátrium-metakrilát, akril - -amid, hidroxi-etil-metakrilát, akriloil-piperidin-4-spiro-2’- ( 1 \3’-dioxakrilo-pentán), 1 -akriloil-4-piperidon és akriloil-metoxi-amin. Általában előnyösek a vízoldható monomerek vagy monomer keverékek, melyek térhálósítószer .nélkül polimerizálva vízoldható polimereket képeznek. A monomer keverék általában tartalmaz (az összes monomer tömegére számítva 0,1 — 5 t%) vinilvegyületet térhálósítási pontok kialakítása céljából, melyek háromdimenziós polimer térhálóhoz vezetnek. Álatalában megfelelőek a vinilpolimerizációhoz használatos iniciáló rendszerek, mint például ammónium-perszulfát -1- nátrium-1.1 biszulfit, hidrogénperoxid-f-ferro-szulfát, kálium-szulfát+N,N,N’,N’-tetrametil-etiIén-di■amin és a riboflavin (fény jelenlétében). Egy másik módszer szerint valamely nem-kovalens kötés is megadhatja az izomeráz molekulának a kívánt merevséget, s ezáltal a hőstabilitás jelentős mértékű növekedését. Ez történik például, ha az izomerázt mechanikusan beágyazzuk egy térhálós polimer gélbe. Ez esetben nem szükséges, hogy a polimerizálás előtt az izomerázt vinilvegyület bevitelével módosítsuk. A gél koncentrációjának azonban 30 tömeg%-nál nagyobbnak kell lennie, mielőtt jelentős mértékű stabilizálás következnék be; előnyösek a körülbelül 50 t% koncentrációjú gélek. Polimer gélek kialakításához olyan monomereket kell alkalmazni, melyek az izomerázzal elektrosztatikus és hidrogénkötéseket tudnak képezni, mint például: nátrium-akrilát, nátrium-metakrilát, akril-amid- vagy hidroxi-etil-metakrilát. A gélekbe történő beépítéssel végzett stabilizálásra példák találhatók a következő forrásokban: Martinék és munkatársai, Biophys, Acta 485, 13—28 (1977); Kulys és munkatársai, J. Solid Phase Biochem., 3, 95— 105 (1978). Az izomeráz kimerevítésének harmadik módszere az intramolekuláris térhálósítás, ami kellőképpen megnövelheti a hőstabilitást. Ilyen stabilizálásra példák találhatók a következő leírásokban: Torchilin és munkatársai (Biophys. Acta, 522, 277—283 (1978)), Martinék és munkatársai (J. Solid Phase Biochem, 2, 343—85 (1977)), valamint Torchilin és munkatársai (Biophys. Acta, 568, 1 — 10 (1979)). A találmány szerinti eljáráshoz megfelelő térhálósítószerek az olyan bifunkciós vegyületek, melyek reagálni képesek az enzimmolekulá felületén elhelyezkedő funkciós csoportokkal. Ezek a funkciós csoportok többnyire aminocsoportok, mégpedig általában olyan primer aminocsoportok, melyek reak' cióba léphetnek egy sor olyan funkciós csoporttal, mint például karboxilsav, szulfonil-halogenid, aldehidek, izocianátok, propiolátok, stb. A térhálósítószerek tehát lehetnek dikarboxilsavanhidridek, mint például szukcinsavanhidrid vagy adipinsavanhidrid; a megfelelő dialdehidek, mint például glioxál, szukcinaldehid vagy glutáraldehid; telítetlen vegyületek, mint például akrolein vagy krotonaldehid, diol-propiolátok, mint például etilén-glikol-biszpropiolát, propilén-glikol-biszpropiolát, vagy hexametilénglikol-biszpropiolát; továbbá diszulfonil-halogenidek, mint például benzol-1,3-diszulfonil-klorid, naftalin-l,5-diszulfonil-klorid vagy tolii-2,4-diszulfonil-klorid. Továbbá, minthogy az enzim tartalmazhat aminokkal szemben reakcióképes savas csoportokat — vagy átalakíthatjuk oly mó-12 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
