199562. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás glükóz izomerizálására
HU 199562 B glükóztartalmú folyadékok az alkalmazott szénhidrát-forrástól és a hidrolízis módjától függően általában tartalmaznak kis mennyiségű poliszacharidot, cukor-oligomereket, stb. A találmány szerinti glükóz-konverzióhoz kiváló keményítő-források a gabonamagvak, mint például a kukorica, cirok, búza, rozs, és a többi, valamint a keményítőtartalmú gumók és gyökerek, mint a burgonya, jamgyökér, répafélék, manióka, és a többi. Az egyesült államokban különösen kedvelt a viszonylag olcsó és könnyen beszerezhető-kukorica keményítő. Minthogy az élelmiszer-minőségű glükóz előálításához kedvezően alkalmazható az enzimes keményítőhidrolízálás, ez az eljárás itt is előnyösen használható. Enzimes hidrolízálási módszerek leírása megtalálható például a 4,017,363, 3,912,590, .3,922,196, 3,922,197-201 és a 4,284,722 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban, melyeknek megállapításaira itt hivatkozunk. Az itt kémiai stabilizálással alkalmazott glükóz-izomeráz enzimet izolálhatjuk bármely ismert, glükóz izomerázt termelő mikroorganizmusból, mint például Streptomyces flavorirens, Streptomyces achromogenes, Streptomyces echinatus, Streptomyces albus, Streptomyces wedmorensis, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces bobiliae, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces venezuelae, Aerobacter aerogenes, Aerobacter cloacae, Bacillus coagulans, Bacillus megaterlum, Bacillus fructosus, Brevibacterium pentaaminoacidicum, Eschericia intermedia. Leucoriostoc mesenteriodes és Paracolobactrum aerogenoides. Ezen kívül felhasználhatunk Nocardia, Micromonospora, Microbispora Microellobospora vagy Arthrobacter fajták által termelt glükóz-izomeráz enzimeket is. Mint említettük, előnyös az olyan glükóz-izomerázok használata, melyek az itt alkalmazott viszonylag magas izomerizálási hőmérsékleten stabilak maradnak. Ilyen például a Bacillus streatőtermophilus, különösen pedig az ATCC 21,365, az NRRL B-3680, az NRRL B-3681 vagy az NRRL B-3682 jelű Bacillus streao-termophilus törzsek által termelt glükóz-izomeráz, amint az a 3,826,714 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban megtalálható; az Ampullariella mikroorganizmus-félékhez tartozó Ampullariella digitata, Ampullariella lobata, Ampullariella campanulata és Ampullariella reguláris által termett glükóz-izomeráz (4,308,349 számú egyesült államokbeli szabadalmi léírás), a Bacillus licheniformis által termelt glükóz-izomeráz (41213 számú Európa-szabadalmi leírás); valamint a 74 30588 számú japán szabadalmi leírásban ismertetett thermophiles nemzetség által termelt glukóz - -izomeráz. A fent felsorolt mikroorganizmusokon kívül a találmány szerinti eljárásban felhasználhatók azok mutánsai és variánsai, vala-3 'mint az azokból genetikai átalakítással származtatott mikroorganizmusok, amely genetikai átalakítás abból áll, hogy mutáció útján kapott glükóz-izomeráz géneket más, például mezofil Vagy termofil mikroorganizmusokba ültetnek be. A találmány céljára az olyan mutált glükóz-izomeráz gének megfelelőek, melyek magas hőmérsékleten — előnyösen 90°C felett, még előnyösebben 125°C-ig — stabil glükóz-izomeráz enzimet termelnek. Ilyen gének előállíthatok a mikroorganizmusok mutációjához szokásosan alkalmazott módszerekkel, például besugárzással vagy kémiai mutagénekkel. Egy másik eljárás, hogy olyan izolált glükóz-izomeráz géneken, melyek mérsékelt hőstabilitású glükóz-izomerázt termelnek (ilyen például az egyes Streptomyces törzsek által termelt glükóz-izomeráz), in vitro mutációt hajtanak végre. A megfelelően mutált gének kiválasztása úgy történik, hogy a mutált gént vagy a termelő vagy pedig más organizmusba ültetjük be, az organizmust továbbszaporítjuk és vizsgáljuk a kapott glükóz-izomeráz hőstabilitását. A rekombinációs DNA-eljárások ugyancsak alkalmazhatók jobb hőstabilitású glükóz-izomeráz előállítására, mely kémiai stabilizálás után a találmány céljaira felhasználható. Argos és munkatársai (Biochemistry 18/25/:5698—5703 (1979)) kimutatták, hogy termofil organizmusokból származó enzimekben a megfelelő mezofil organizmusokból szárma-zó enzimek egyes alanincsoportjai glich-, szeril-, valil-, illetve lizilcsoportokkal vannak helyettesítve. Perutz (Sciene, 201, 1187- -91 (1978) megállapította, hogy a termofil baktériumok főleg a protein felületén található addíciós sókötéseknek köszönhetik rendkívüli hőstabilitásukat. Zuber („Biochemistry of Thermophily“, Freidman, S.M. kiadás, 267—285, Academic Press, N.Y., 1978) további adalékokat szolgáltat a nagy hőstabilitású enzimek szerkezetéhez. Ha ismerjük a glükóz-izomeráz enzim aminosav-szekvenciáját és térbeli (tercier) szerkezetét, akkor az izomeráz génben végrehajtott hely-specifikus mutációkkal fokozhatjuk a hőstabilitást oly módon, hogy olyan enzimeket állítunk elő, melyek nagyobb mennyiségben tartalmazzák a szerkezet stabilitását biztosító aminosavakat. A glükóz-izomeráz DNA-szekvenciájának meghatározása után génszintezátort használhatunk új szekvenciák kidolgozására, melyek az ilyen mesterséges gének által előállított glükóz izomeráz hőstabilitásának növelésére szolgálnak. Az ily módon megtervezett enzimek különösen hasznosak lehetnek e találmány gyakorlati megvalósításához. Minthogy az említett és egyéb mikroorganizmusok a glükóz-izomerázt a sejten belül termelik, a glükóz-izomeráz egyik forrása, hogy a sejteket egyszerűen összegyűjtjük, és a technikában ismert módszerek valamelyikével — például a sejtek autolízi-4 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
