199562. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás glükóz izomerizálására
sével vagy ultrahangos roncsolással — kiválasztjuk belőlük az enzimet, melyet azután az ismert és hagyományos szerkezetű enzimreaktorban használunk fel. Ha a glükóz-izomeráz a kémiai stabilizálás következtében nem válik oldhatatlanná, akkor előnyösen valamely inert hordozóanyagon köthetjük meg az ismert és hagyományos eljárásokkal. Az enzimek megkötéséhez használatos anyagok és eljárások jól ismertek, leírásuk egy sor közleményben megtalálható, többek között: Wang és munkatársai Fermentation and Enzyme Technology (Erjesztéses és enzimes eljárások), John Wiley and Sons, Inc., New York (1979), pp. 318— 338, valamint Kirk Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3. kiadás John Wiley and Sons. Inc., New York (1980) 9. kötet, pp. 148—172. A 28,885 számú, újra kiadott egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint kis mennyiségű kobalt-, mangán- vagy magnézium-kation és/vagy a kénessav vízoldható sói— például nátrium-szulfit, nátrium-biszulfit, magnézium-szulfit és/vagy magnézium-szulfit és/vagy magnézium-biszulfit — jelenléte csökkenti vagy megakadályozza a glükóz-izomeráz enzim denaturálódását a művelet során. Jó ererdmények eléréséhez az szükséges, hogy a glükóztartalmú kiindulási oldat szénhidrogén-koncentrációja körülbelül 20 és 85 tömeg% között, előnyösen 30 és 50 tömeg% között legyen. Az izomerizáiást olyan pH-értéken kell végezni, mely 5,5—7,5, előnyösen 5 és 6,5 közé esik. Ha az izomerizáiást a fent megadottaknál lényegesen alacsonyabb vagy magasabb pH-értéken végezzük, akkor nagy mennyiségű nemkívánatos melléktermék — például pszikóz, szerves savak, színes termékek, színezék közbenső termékek, fruktóz-dianhidridek, és a többi — képződik. Megállapítottuk, hogy magas hőmérsékleten a glükóz izomeráz enzim hatása szempontjából optimális pH érték lényegesen alacsonyabbá válik. Például a Streptomyces rubigenosus-ból nyert glükóz-izomeráz hatás-optimuma 25°C-on pH=8,6 és 9,2 75°C-on pH=6,9 és 7,5, 125°C-on pedig pH=5,6 és 6,2 közé esik. Thát az izomerizálási hőmérséklet növelésével párhuzamosan csökkenthetjük a közeg pH-ját, hogy fenntartsuk az enzim maximális hatásosságát és elkerüljük a nemkívánt melléktermékek képződését. A találmány szerinti eljárásnak egy további követelménye a glükóztartalmú nyers oldat és a kémiailag stabilizált glükóz-izomeráz érintkezési idejére vonatkozik. Ahhoz, hogy elfogadható minőségű fruktóz szirupot kapjunk, ezt az időtartamot körülbelül 1 másodperc és 5 óra, előnyösebben körülbelül 30 másodperc és 1 óra, a legelőnyösebben pedig 2 perc és 30 perc közötti értékre kell beállítani. A kémiailag stabilizált glükóz-izomeráz és a glükóztartalmú nyers oldat közötti érint5 4 kezési idő előnyös értéke erősen függ attól, hogy az izomerizáiást milyen pH-értéken végezzük. A megadott pH-tartomány alsó határa közelében hosszabb tartózkodási időt engedhetünk meg anélkül, hogy a glükóz és fruktóz — pszikóz és egyéb nemkívánatos bomlástermékek képződése közben — elbomlana. A tartomány felső határán az érintkezési időnek rövidebbnek kell lennie, hogy elkerüljük a pszikóz és a színezőanyagok képződését. A gyakorlatban azt a teljes időtartamot, amit a glükóztartalmú szirup a reakció véghőmérsékletén vagy ahhoz közeli hőmérsékleten tölt el, bomlási időnek (tj) tekintjük, minthogy az itt végbemenő cukorbomlási reakciók nem enzimes természetűek, és ezek lejátszódása független attól, hogy a szirup érintkezik-e glükóz-izomerázzal. A bomlási idő (trf) tartalmazza az enzim és a szubsztrát tényleges érintkezésének időtartamát (t0), valamint mindazt a kezelési időt, melyet a tápoldat a reakcióhőmérsékleten vagy annak közelében tölt el, például a reaktorban történő bevezetés, illetve az abból való eltávolítás időtartamát. A tényleges érintkezési idő (to) az az időtartam, melynek eltelte alatt az enzim reakciókapcsolatban áll a szubsztráttal, vagyis az enzim és a szubsztrát közvetlenül érintkezik egymással. Ezért, ha az izomerizáiást 90°C felett végezzük, fontos, hogy minimálisra csökkentsük a glükóztartalmú oldatnak az izomerizálási hőmérsékletre való felmelegítéséhez szükséges időt (például úgy, hogy az oldatot közvetlenül az izomerázzal történő érintkezés előtt vagy annak folyamán gőzzel keverjük), és amint a kívánt fruktóztartalmat elértük, gyorsan válasszuk el az oldatot az aktív izomeráztól, majd pedig a lehető leggyorsabban hűtsük 90°C alatti, előnyösen 70°C alatti hőmérsékletre. Hogy elfogadható szirup-termékeket kapjunk, a fruktóz vagy a glükóz nemkívánatos lebomlása nélkül a bomlási időt az alábbi egyenlet szerinti értékre, vagy annál kisebbre kell beállítani: td=antilog [4300/ (T+273) -pH-3,23], ahol ta a bomlási idő percben; T a reakcióhőmérséklet °C-ban; pH pedig a reakciókeverék pH-ja azon idő alatt, amit a keverék a reakcióhőmérsékleten tölt el. A fenti egyenlet, azt mutatja, hogy a-tényleges érintkezési idő annál rövidebb lehet, minél magasabb a hőmérséklet és/vagy minél nagyobb a pH-érték. A reakcióhoz rendszerint olyan pH-értéket alkalmazunk, mely a választott izomeráz-enzim számára optimális, vagy annak közelében van. Ha például az enzim számára az optimális pH=6, és a* reakcióhőmérséklet 110°C, akkor a bomlási időt (mely magában foglalja az érintkezési időt) 100 perc körüli, vagy kisebb értékre kell beállítani. A hőmérsékletet (T) a szubsztrát összetétele és az elérendő fruktóztartalom szerint 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
