199559. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 10255 antibiotikum komplex és faktorai, valamint ezeket tartalmazó készítmények előállítására
HU 199559 B frakció faktor termék (g) 11—23. C, F 0,68 30—63. B, E 6,50 A B és E frakciókat tartalmazó eluenst 400 ml térfogatúra töményítjük. A keletkezett csapadékot szűréssel összegyűjtjük, csökkentett nyomáson szárítjuk, 5,86 g anyagot nyerve, ami főleg B faktorból és egy kevés E faktorból áll (3,6 g aktivitás). A csapadék anyalúgját tovább töményítjük, a betöményített oldathoz dietil-étert adva, 0,64 g csapadékot kapunk, ami a B és E faktorok hasonló keveréke (0,3 g aktivitás). 4. példa Az A10255 B faktor elválasztásához a 3. példa 30—63. frakciójából nyert anyag 1,5 grammját 150 ml tetrahidrofurán/víz, 35:65 arányú elegyében oldjuk. 8x100 cm méretű rozsdamentes acélcsőben 4 liter LP1-C18 fordított fázisú szilikagélből oszlopot készítünk, és erre visszük a fenti oldatot. (A szilikagélt Abbot és munkatársai 1981. novemfrakciók í 53 bér 10-én kibocsátott 4 299 763 számú USA szabadalmak 6. és 7. példájában leírtak szerint készítjük el). Az oszlopot 12 liter tetrahfdrofuran/víz/dinátrium-hidrogén-foszfát, 5 3:7:0, 0,5M (pH= 7,8, foszforsavval beállítva) eluenssel eluáljuk, 60 ml/perc átfolyási sebességnél 240 ml-es frakciókat gyűjtve. A detektálást 280 nm-en végezzük. Az egyes frakciókat analitikai HPLC-vel vizsgáljuk 10 meg. Az analitikai HPLC-hez 5 mikronos ultrasphere ODS fordított fázisú adszorbenssel (Altex Scientific Inc., Berkley, CA, USA) 15 töltött, 4,6x250 mm méretű rozsdamentes acéloszlopokat használunk. Az eluálás tetrahidrofurán/víz/nátrium-hidrogén-foszfát, 1:2:0, 05M eleggyel történik (pH = 7,8, foszforsavval beállítva), 1 ml/perc átfolyási se- 20 besség mellett. Detektálás 254 nm-nél. Az alábbi frakciókat egyesítjük: 54 17~23. B (szennyezett) 150 ml 2h-35. B (tiszta) 200 ml 38-45. E A betöményített, egyesített 24—35. frakciót 300 ml ionmentes vízben oldjuk, az oldat kémhatását foszforsavval pH = 3,0 értékre állítjuk be. Az oldatot kloroform/metanol, 7:3 eleggyel extraháljuk. Az extraktumot szárazra pároljuk, és HPLC-vel elválasztjuk. A kromatografálást nagy elválasztóképességű, alacsony nyomású folyadékkromatografálással („HPLPLC") végezzük 100— 200 mikronos szilikagél hordozóval (Woelm Pharma) töltött üvegoszlopon (K. Michel és munkatársai, 1978. december 26-án kibocsátott 4 131 547 számú USA szabadalom). Az eluálást kloroform/metanol 7:3 arányú elegyével végezzük, az eluátumot 254 nm-nél detektálva. Az UV pozitív anyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk, és fagyasztva szárítjuk, 659 mg B faktort nyerve. A termék fizikai állandóját a leíró részben ismertettük. 5. példa Az A10255E faktor tisztításához a 4. példa LP1-C18 gyantán végzett kromatografálást ötször elvégezve, az egyes kromatografálások egyesített 38—45. frakcióit összeöntve, 800 ml eluenst kapunk, melynek kémhatását pH=3,0 értékre állítjuk be foszforsavval. Az oldatot 2x800, majd 400 ml kloroform/ /metanol, 7:3 arányú elegyével extraháljuk, az extraktumokat egyesítjük, szárazra párol-100 ml juk és a maradékot 50 ml kloroform/metanol, 7:3 elegyben oldjuk. Az oldatot 500 ml 100—200 mikronos szilikagélhordozóval (Woelm) töltött 5,1x42 cm méretű Michel- 35 -Miller HPLPLC üvegoszlopra visszük. Az eluálást kloroform/metanbl, 7:3 (térfogat) eleggyel végezzük. A 254 nm-nél elnyelést mutató frakciókat összegyűjtjük, szárazra pároljuk, 349 mg tiszta E faktorhoz jutva. 40 A termék fizikai állandóit a leíró részben ismertettük. 6. példa Az A10255 C és E faktor tisztításához a 3. példa szerinti 11—23. frakciókból elő- 45 állított 3,03 g szilárd anyagot tetrahidrofurán/víz, 6:4 elegyében oldjuk, és az oldatot 4 liter fordított fázisú szilikagélen, 8x100 cm méretű rozsdamentes acéloszlopban kromatografáljuk, eluensként 39 liter tetrahid- 50 rofurán/víz elegyet használva. Átfolyási sebesség 60 ml/perc, detektálás 280 nm-en. A 480 milliliteres frakciók biológiai aktivitását Micrococcus luteus ATCC 9341 tesztorganizmussal beoltott agarlemezen vizs- 55 gáljuk a papírkorongos módszerrel. A biológiailag aktív frakciókat tovább analizáljuk analitikai HPLC-vel, a 4. példában leírtak szerint. A frakciókat az alábbiak szerint öntjük össze: 28
