199559. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 10255 antibiotikum komplex és faktorai, valamint ezeket tartalmazó készítmények előállítására
55 HU 199559 B 56 frakció faktor termék (mg) 28-37» ismeretlen 186 Zj.O-50. C (szennyezett) 373 51-55» C (.tiszta) 302 56-62, C (szennyezett) 70 66-75» F (tiszta) 56 Valamennyi egyesített frakciót betöményítjük, a csapadékot kiszűrjük és csökkentett nyomáson szárítjuk. A C és F faktor fizikai állandóit a leíró részben ismertettük. 7. példa Az 1. példában ismertetett összetételű ferdeagart A10255 antibiotikumot termelő NRRL 18260 törzzsel oltjuk be. Az ismertetett módon nyert, fagyasztva szárított pellettel 250 ml-es széles szájú Erlenmeyer lombikban beoltunk 50 ml alábbi összetételű táptalajt: Trypticase szója 30,0 g enzim-hidrolizált kazein (Universal Foods, Junean, WI, USA) 5,0 g glükóz 5,0 g glicerin 10,0 g dextrin 10,0 g kálcium-karbonát 10,0 g csapvízzel kiegészítve 1 literre. A táptalaj kémhatását a sterilezés előtt nátrium-hídroxid vizes oldatával pH=7,0 értékre állítjuk be. A beoltott vegetatív táptalajt 72 órán keresztül inkubáljuk 30°C hőmérsékleten 5 cm kitérésű körkörös rázógépen 250 percenkénti fordulatszámmal. A kapott vegetatív tenyészetet használjuk kis fermentorok beoltására (1% oltóanyaggal), vagy nagyobb térfogatú oltóanyag előállítására a kétlépcsős inokulumkészítésnél. Két széles szájú, kétliteres Erlenmeyer lombikba 400—400 fenti összetételű vegetatív táptalajt töltünk. Mindegyik edényt beoltjuk a fentiek szerint kapott vegetatív tenyészettel. Oltáshoz a táptalaj 2,5 térfogatszázalékának megfelelő oltóanyagot .használunk. A beoltott táptalajt 48 órán keresztül inkubáljuk 30°C hőmérsékleten egy, a vízszinteshez 10°-os szögben álló rázótálcán, 250 percenkénti fordulatszámnál. A fenti '»enyészet 800 milliliterével beoltunk 100 liter alábbi összetételű táptalajt: alkotórész mennyiség (g/1) Sag 471 0,2 P-2000 0,1 ml glükóz 1.0 ammónium-klorid 1,0 nátrium-szulfát 2,0 cink-klorid 0,019 magnézium-klorid-6 víz 0.304 20 vas(III)-klorid 0,062 mangán (11)-klorid-4 víz 0,035 kálcium-klorid 0,06 réz-klorid-2 víz 0,005 kálium-dihidrogén-foszfát* 25 csapvízzel a térfogatot 0,67 feltöltve 110 literre. x A kálium-dihidrogén-foszfát ionmentes vízben készült oldatát külön sterilezzük, miután 30 kémhatását kálium-hidroxiddal pH=6,0 értékre állítottuk be. A táptalajt 165 literes fermentorba töltjük, gőzzel sterilezzük 121°C hőmérsékleten. 35 Sterilezés-után a táptalaj kémhatása pH=8,3. A kálium-dihidrogén-foszfát oldat hozzáadása után a kémhatás pH=7,0-re változik. A beoltott táptalajt steril levegővel levegőztetjük, miközben szokásos keverőberendezéssel 40 kevertetjük. A levegőáramlást úgy állítjuk be, hogy az oltott oxigén szintje a 3,5* 104 Pa nyomásnál kialakuló levegőtelítettségi szint 45%-át érje el. A fermentálást 7 napon át végezzük 30°C hőmérsékleten. 4- A fenti nagyméretű fermentálásnál úgy találtuk, hogy hatásos, ha naponként és literenként 5,7 g glükózt adunk a fermentléhez. A 17. óra után kazeint is adagoltunk a tenyészethez, naponként és literenként 4,5 g-ot. 50 8. példa Az 10255G faktor elválasztásához 1,0 g, 2. példa szerint kapott antibiotikum komplexet feloldunk 2 liter víz/acetonitril, 4:1 arányú elegyében pH==6,0 kémhatásnál. Az ol- 55 datot egy Waters Prep 500 készülék C18 készoszlopára (cartridge) visszük. Az oszlopot enyhe emelkedésű gradienselúcióval eluáljuk, amit 4 liter viz/acetonitril/tetrahidrofurán/ecetsav, 70:30:5:0,5 oldatnak 4 li„ ter víz/acetonitril/tetrahidrofurán/ecetsav, 60 65:35:5:0,5 ji_ oldathoz való adagolásával állítunk elő. Átfolyási sebesség 250 ml/perc, percenként gyűjtünk egy frakciót. Ezt követően 2 liter £ oldattal pluálunk. Az eluátumot 280 nm-en detektáljuk. Hét kromatografá- 05 lást futtatunk le azonos módon. A C és G fak-29
