199559. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A 10255 antibiotikum komplex és faktorai, valamint ezeket tartalmazó készítmények előállítására
HU 199559 B I A S.gardneri NRRL 15537 törzs spóráival beoltjuk a fenti sterilizált táptalajjal készített ferdeagarokat. A beoltott ferdeagarokat 30°C hőmérsékleten inkubáljuk 7—10 napon keresztül. A kinőtt tenyészetet borjúszérummal fedjük, és a spórákat és a micéliumot steril eszközzel lekaparjuk. A szuszpenziót kis csövekbe osztjuk szét, és fagyasztva szárítjuk eltartásra. Ezzel a liofilizált peljettel oltunk be 250 milliliteres szélesszájú Erlenmeyer lombikban levő 50 ml alábbi összeté51 telű táptalajt: glükóz 15,0 g dextrin 20,0 g szójadara 10,0 g kukoricalekvár 10,0 g élesztőkivonat 1,0 g kálium-karbonát 2,0 g csapvízzel kiegészítve 1 literre. A táptalaj kémhatását nátrium-hidroxid vizes oldatával beállítjuk pH=6,7 értékre. Autoklávban való sterilizálás után a kémhatás pH=6,8—7,0. A beoltott vegetatív táptalajt 30°C hőmérsékleten rázatjuk 5 cm kitérésű rázógépen, percenként 250 fordulatszámmal 48 órán keresztül. A kapott vegetatív tenyészetet használjuk fel kis fermentorok (1% oltóanyagot adva) beoltásra, vagy nagyobb térfogatú oltóanyag előállításához a kétlépéses inokulum készítésnél. A második lépés tenyészetének elkészítéséhez a következő összetételű táptalajt használjuk: glükóz 15,0 g dextrin 20,0 g szójadara 15,0 g kukoricalekvár 10,0 g élesztőkivonat 1*,0 g kálcium-karbonát 5,0 g csapvízzel kiegészítve 1 literre. 2 literes szélesszájú Erlenmeyer lombikban 400 ml táptalajt beoltunk a fenti tenyészettel. Az oltóanyag a lombikban levő táptalaj térfogatának 2,5%-a. A beoltott táptalajt 30°C hőmérsékleten inkubáljuk 24 órán keresztül, percenként 250-es fordulatszámmal rázatva egy 10°-os rázótálcájú körkörös rázógépen. A fenti tenyészet 800 milliliterével oltjuk be az alábbi összetételű 100 literes táptalajt: alkotórész mennyiség, g/liter habzásgátló (Dow-Corning) propilénglikol (MW 2000) glükóz glicerin Bacto-Pepton (Difco Lab.hus-hidrolizátum) kazein nátrium-dihidrogén-foszfát-viz melasz kálcium-karbonát csapvízzel kiegészítve 0,20 g 2.00 ml 10.00 g 40.00 g 10.00 g 10,00 g 0,1 g 40.00 g 25.00 g 100 literre. A 100 liter táptalajt egy 165 literes fermentorba töltjük. A táptalaj összetételét 5n nátrium-hidroxiddal pH=6,9 értékre állítjuk be. A keveréket 45 percen át sterilezzük 121°C 5 hőmérsékleten 0,13—0,14 MPa nyomáson. A sterilezés .után a táptalaj kémhatása pH= =7,0. A beoltott tenyészetet percenként a tenyészet térfogatának 0,125-öd részének megfelelő steril levegővel levegőztetjük, mi- 10 közben szokásos keverőberendezéssel kevertetjük percenként 200 fordulatszám mellett. A fermentálást 6 napon keresztül végezzük. 30°C hőmérsékleten. 15 2. példa 3780 liter fermentlevet szűrési segédanyag (Hyflo Super-Cel, Johs-Manville Products Corp.) jelenlétében leszűrünk. A kipréselt, kiszűrt micéliumot 300 liter vízzel mossuk, 20 majd a micéliumot aceton/víz, 4:1 arányú elegyével kétszer extraháljuk. Az első extraktum 900 liter, a második 800 liter térfogatú. Az extraktumokat egyesítjük, és csökkentett nyomáson bepároljuk, amíg a térfogat 450 li- 25 ter vizes oldat nem lesz. Az oldat kémhatását sósavval pH=3,0 értékre állítjuk be, majd etil-acetáttal háromszor extraháljuk — az extraktumok térfogatai: 165, 280, illetve 225 liter. Az extraktumok és a vizes fázis bioló- 3- giai aktivitását papírkorongos módszerrel analizáljuk B. subtilis ATCC 6633 tesztorganizmussal beoltott agarlemezen. Az extraktumokat egyesítjük és térfogatát 23 literre töményítjük csökkentett nyomáson. A betö- 3g ményítés. alatt kiváló csapadékot kiszűrjük, csökkentett nyomáson szárítjuk, 216 g A10255 antibiotikum komplexet nyerve (90,7 g aktivitás). A szűrletet tovább töményítjük 900 ml térfogatra, majd az ekkor kivált csapadékot 4Q is kiszűrjük és szárítjuk, 16,2 g A10255 antibiotikumkomplexhez jutva (9,1 g aktivitás). 3. példa Az egyes faktorok elválasztását az alábbiak szerint végezzük. 20 g Al0255 komple- 45 xet kloroform/metanol 9:1 arányú elegyének 400 milliliterében oldunk és az oldatot szűrjük. A szűrletet egy 8x100 cm méretű rozsdamentes acélcsőben 4 liter 13—24 mikronos LPS-1 szilikagélből (Whatman Che- 00 mical Separation Inc., Clifton, New Yersey, USA) kialakított oszlopra visszük. A kromatografáláshoz egy Chromatospac Prep-100 készüléket használunk (Jobin Yvon, 16—18 Rue du Canal 91160, Longjumean, Francia- 55 ország). 240 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az eluens kezdetben kloroform/metanol, 9:1 arányú elegye (7 liter), majd kloroform/ /metanol, 3:1 arányú elegye (15 liter). Az átfolyási sebesség 60 ml/perc. A detektálást 60 280 nm-en végezzük. Valamennyi frakció biológiai aktivitását Micrococcus luteus ATCC 9341 tesztorganizmussal beoltott agar lemezen analizáljuk a papirkorongos módszerrel. A frakciókat az alábbiak szerint gyűjtés jük össze: 52 27 í
