199558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz izomeráz enzim tisztítására
HU 199558 B zil-, dihalogén-benzil- vagy naftil-metil-csoport; R2 jelentése 10—18 szénatomos alkilvagy (diizobuti 1-fenoxi) -etoxi-eti 1-csoport; R3 jelentése 1—4 szénatomos alkilcsoport; R4 jelentése hidrogénatom vagy 1—4 szénatomos alkilcsoport; és X~jelentése anion, előnyösen halogenid anion; — kezeljük, az oldatra számítva 500— 5000 ppm koncentrációban, az így keletkezett enzimtartalmú csapadékot ismert módon elkülönítjük, majd kívánt esetben újból oldatba visszük egy szervetlen ionos sót tartalmazó vizes közegben. X- jelentése bármilyen, az enzimre nézve inert szervetlen vagy szerves anion lehet, így például halogenid, nitrát, szulfát, benzolszulfát, acetát. A találmány szerinti eljárás vizes oldatban lévő glükóz izomeráz tisztítására alkalmas. A glükóz izomerázt valamilyen kvaterner-aminnal kezeljük olyan körülmények között, ahol az amin kapcsolatba lép az izomerázz al, oldhatatlan enzim-amin komplex képződése közben. A kapott izomeráz-amin komplexet valamilyen erős ionos oldathoz adhatjuk, ahol a komplex disszociál és így oldható, tiszta, koncentrált glükóz izomeráz készítmény keletkezik. Bizonyos amin vegyületek esetében meglepő és váratlan volt, hogy ezek a vegyületek glükóz izomeráz készítmények tisztítási eljárásában az enzim kicsapására használhatók. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott (I). általános képletű vegyületek lehetnek például: dimetil-benzil-dodecii ammonium-, dimetil-dilauril ammonium-, sztearil-dimetil-benzil ammonium-, dietil-dioktadecil ammonium-, dimetil-di dodecil ammonium-, dimetil-dodecil-naftil-metil ammonium- és dimetil-hexadecil-diklór-benzil ammonium sók. A találmány szerinti eljárásban a fent felsorolt amin vegyületek valamelyikét a megfelelő módon tisztított glükóz izomeráz vizes extraktumhoz adjuk. Az amin reakcióba lép a glükóz izomerázzal és egy oldhatatlan izomeráz-amin komplex keletkezik, amely kicsapódik. Az oldhatatlan izomeráz-amin komplexet ezután ismert módon, például szűréssel, centrifugálással, elkülönítjük. Az enzimet a csapadékból eltávolítandó az izomeráz-amin komplexet egy ionizált sóoldathoz adjuk, amikor is a komplex disszociál, az izomeráz és az amin újra oldatba megy. Ezután az amin vegyületet az enzimes oldattól ultraszűréssel vagy kationcserélő gyantával való kezeléssel választjuk el, így egy tisztított, nagy fajlagos aktivitású (aktivitás/ /protein mg) koncentrált glükóz izomeráz készítményt kapunk. 3 A kicsapódott enzim-amin komplex visszaoldásához szükséges ionizált só mennyiségét egyszerű eljárásokkal, megfelelő elektrolitek, előnyösen nátrium-klorid különböző koncentrációjú, azaz ionerősségű oldatainak felhasználásával határozhatjuk meg. Bármilyén elektrolit alkalmazható, feltéve ha nem hat gátlóan a glükóz izomerázra. A só szükséges mennyiségét az a minimális koncentráció határozza meg, amely ahhoz szükséges, hogy a csapadék feloldódjék. Mivel a nátrium-klorid nem mutat semmi észrevehető hatást az enzim aktivitására, alkalmazhatunk olyan koncentrált oldatot, ami biztosítja a csapadék teljes feloldódását. Bizonyos esetekben a vizes enzim oldat tartalmazhat olyan szennyeződéseket, amelyek az elegyhez adott amin vegyülettel csapadékot képeznek, mielőtt a kívánt enzim kicsapódna. Ilyen esetekben előnyös, ha az amin vegyületet több részletben, előnyösen két részletben adjuk az oldathoz, amikor is az első részlet hozzáadása után kicsapódnak a szennyeződések, és a második részlet hozzáadása után pedig az enzim. Az első lépésben alkalmazandó amin mennyiségét könnyen meghatározhatjuk úgy, hogy az eredeti enzim oldatból egy alikvot mennyiséget veszünk, és ehhez adjuk hozzá fokozatos mennyiségekben az amint. Minden amin-beadagolásnál megnézzük a keletkezett csapadék enzimaktivitását: amikor az enzimaktivitás megjelenik, ez jelzi, hogy milyen mennyiségű amin hozzáadására van szükség az első fázisbeli csapadék kiválásához. A találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazhatók azok az (I) általános képletü vegyületek, ahol R2 jelentése 12—18 szénatomos alkilcsoport, R, jelentése 8—10 szénatomos alkilcsoport, R3 és R4 jelentése 1—4 szénatomos alkilcsoport, X jelentése pedig halogenid anion. Legelőnyösebb vegyületek a (II) általános képletü vegyületek, ahol n jelentése egész szám, melynek értéke 12, 14 vagy 16, X jelentése pedig halogenid anion. Ezeket a vegyületeket tartalmazza egy kereskedelmi termék, amely BTC-835 néven kapható (Onyx Chemical Co., Jersey City). A BTC-835 egy keverék, amely 50%-ban olyan (II) képletű vegyületet tartalmaz, ahol n értéke 14, 40%ban olyan vegyületet tartalmaz, ahol n=12, és 10%-ban olyan vegyület van benne, ahol n=16. A találmány szerinti eljárás reakciókörülményei az izomeráz extraktum tisztaságától és koncentrációjától, valamint az alkalmazott amin vegyülettől függenek. Az amin mennyisége annyi kell legyen, amennyi elegendő gyakorlatilag az összes aktív enzim kicsapásához. Előnyös mennyiség minimálisan körülbelül 500 ppm-től körülbelül 5000 ppm-ig. Legelőnyösebb mennyiség körülbelül 1000 ppm-től körülbelül 3000 ppm-ig. 4 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
