199558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz izomeráz enzim tisztítására
HU 199558 B A pH-nak olyan tartományon belül kell ‘lennie, ami az enzim izoelektromos pontjánál (pl) körülbelül egy pH egységgel magasabban, a használt amin vegyület pKa értékénél pedig körülbelül egy pH egységgel alacsonyabban van. Előnyösen a pH körülbelül 7,0—7,4 érték. A hőmérséklet széles tartományon belül változhat, vagyis 0°C-tól addig a hőmérsékletig terjedhet, ahol az enzim hődenaturálódása vagy inaktiválódása bekövetkezik. A gyakorlatban legelőnyösebb az eljárást szobahőmérsékleten végrehajtani. A találmány szerinti eljárás mechanizmusa nem teljesen bizonyított. Feltételezésünk szerint az amin kapcsolatba lép a glükóz izomerázzal egy oldhatatlan izomeráz-amin komplex keletkezése közben. Ha az oldhatatlan izomeráz-amin komplexet egy erősen ionos oldathoz adjuk, az izomeráz-amin komplex disszociál, az izomeráz és az amin újra feloldódik. A találmány szerinti eljárással kapott eredmények előre nem várhatóak. Meglepő az a tény, hogy a találmány szerinti eljárásban használt, általában hatásos enzim inaktivátoroknak és denaturáló ágenseknek tartott amin vegyületek glükóz izomeráz extraktumok tisztítására használhatók. Meglepő módon nem minden kvaterner ammonium só, vagy tercier amin biztosítja ugyanazt az eredményt, mint amit a találmány szerinti eljárásban alkalmazott specifikus tercier aminok és kvaterner ammonium sók mutatnak. Ismert kvaterner ammonium sók, mint például a hexadecil-trimetil-ammónium-klorid, nem adnak semmiféle csapadékot a találmány szerinti eljárásban leírt körülmények között, míg egyéb amin vegyületek, így például az oktadecil-trimetil-ammónium-klorid, enyhe csapadékképződést mutatnak, s ez a csapadék nem mutat értékelhető enzimaktivitást. Más aminok jelentős enzimaktivitás csökkenést eredményeznek, akár képeznek csapadékot, akár nem. A különlegesen hatékony amin vegyületek azok, ahol R, például benzil-metil-csoportot jelent, R2 jelentése 12—16 szénatomos alkilcsoport, R3 és R4 pedig 1—4 szénatomos alkilcsoportot, előnyösen metilcsoportot jelent. Meglepő volt az is, hogy az izomeráz-amin komplex olyan könnyen disszociál, tiszta aktív enzimet eredményezve. A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként használt glükóz-izomeráz extraktumokat az irodalomban ismert módokon állítjuk elő. Például egy glükóz izomeráz tartalmú enzim extraktumot megkaphatunk úgy, hogy glükóz izomeráz termelő mikroorganizmusokkal fermentálunk, az enzimet extrakcióval kinyerjük a sejtekből és ismert módon eltávolítjuk az oldhatatlan anyagot. Előnyös glükóz izomeráz extraktumokat nyerhetünk az Actinoplanes, Ampullariella, Aerobacter, Arthrobacter, Bacillus, Micromonospora, Microbispora, Microellobospora, Norcardia, vagy Streptomyces nemzetségbe tar5 4 tozó mikroorganizmusok által. A glükóz izomeráz extraktumok legegyszerűbben a Streptomyces rubigenosus, Streptomyces olivochromogenes, Bacillus coagulans vagy Bacillus stearothermophilus törzsekkel nyerhetők. Analitikai módszerek Össz-protein Az össz-protein mennyiséget egy Beckman DK-2A spektrofotométerrel; 280 mp hullámhossznál határoztuk meg. Izomeráz aktivitás — IGIU Az IGIU az International Glucose Isomerase Unit — Nemzetközi Glükóz Izomeráz Egység — rövidítése és azt az enzimmennyiséget jelenti, amely 1 mikromól glükózt 1 perc alatt fruktózzá alakít át egy olyan oldatban, amely kezdetben literenként 2 mól glükózt, 0,02 mól magnézium-szulfátot és 0,001 mól kobalt(II) kloridot tartalmaz 6,84—6,85 közti pH értéken (0,2 M nátrium-mal.eát) környezeti hőmérsékleten és 60°C hőmérsékleten mérve. A glükóz izomeráz meghatározásokat az alábbi irodalomban leírt módszer szerint végezzük: N. E. Lloyd és társai, Cereal Chem. 49, 5. 544—553 (1972). Fix izomeráz aktivitás — FALI A fix izomeráz aktivitást az alábbi módszerrel határozzuk meg. Lemérünk egy 1400—2200 IGIU tartalmú fix izomeráz mintát. Ezt a mintát 125 ml, előzőleg 65°C hőmérsékletre melegített dextróz próbaoldattal és 10 ml 0,1-es trisz-hidroxi-metilamino-metán (THAM) oldattal (pH= =7,8) belemossuk egy 250 ml-es lombikba. A dextróz próbaoldat 3,33 M dextrózt, 20 mM magnézium-szulfátot, 10 mM nátrium-szulfitot, 100 mM THAM-ot és 1 mM kobalt-kloridot tartalmaz (pH=7,8). 65°C hőmérsékleten ez a dextróz oldat pH=7,0 pH értékű. A lombikot egy 65°C-os vízfürdőbe merítjük és 1 órán keresztül rázzuk. A keveréket vákuum-szurjük egy 45 mm-es, üvegszál szűrővel és 1 g szűrési segédanyag előszűrő réteggel töltött durván trittelt üvegtölcséren. A lombikot és az enzimpogácsát 100 mM-os THAM pufferoldat (pH=7,8) kis mennyiségeivel addig öblítjük, amíg 100 ml össztérfogatot el nem érünk. Ezt a mosott enzimet egy 250 ml-es lombikba töltjük, amely lombik 125 ml, előzőleg 65°C hőmérsékletre melegített dextróz próbaoldatot tartalmaz. A mosott enzimet 10 ml 10 m’M-os Tham pufferoldattal (pH=7,8) kvantitatlve belemossuk a lombikba, és a lombikot pontosan 60 percig rázzuk.. Ezután 12,0 ml jégecetes ecetsavat adunk hozzá, és a megsavanyított elegyet még további 15 percig rázzuk. Az elegyet egy, a fent leírt módon megtöltött 45 mm-es üvegtölcséren át vákuum-szflrjük. A lombikot és a tölcsért addig mossuk desztillált vízzel, amíg körülbelül 400 ml szűrletet gyűjtünk össze. Ezt a szűr-6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
