199558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz izomeráz enzim tisztítására
HU 199558 B 2 A találmány tárgya eljárás glükóz izomeráz tisztítására oly módon, hogy az enzimet tartalmazó oldatot (I) általános képletű kvaterner ammonium vegyülettel kezeljük, aminek eredményeképpen enzimaktivitással rendelkező oldhatatlan komplexet kapunk, a komplexet ismert módon elkülönítjük, majd kívánt esetben valamely vizes közegben újból feloldjuk. A glükóz izomeráz egy enzim, amely a glükózt fruktózzá alakítja át. Az irodalomban különféle glükóz izomeráz termelő mikroorganizmusokat ismerünk. Például, az Actinoplanes, Aerobacter, Ampullariella, Arthrobacter, Bacillus, Lactobacillus és Streptomyces nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok termelnek glükóz izomerázt. Általában a glükóz izomeráz elsődlegesen intracellulárisan képződik, igy nagy részét a mikroorganizmusok sejtfalán és/vagy a sejtfalán belül találjuk meg. Ezért ahhoz, hogy oldható enzimet kapjunk, az enzimet ki kell extrahálni a mikróbás sejtekből. Az extrakció eredményeképpen a sejtfal legalább részben szétzúzódik, így lehetővé válik, hogy az enzim és egyéb sejtes anyagok bediffundáljanak a mikrobiális enzim extraktumba. Az enzim extraktum tehát oldható és oldhatatlan szenynyeződéseket egyaránt tartalmaz. Az oldhatatlan szennyeződéseket ismert eljárásokkal, így például szűréssel vagy centrifugálással könnyen eltávolíthatjuk. Az oldható szennyeződések — így a biológiai oligomerek vagy polimerek, például nukleinsavak, nem-enzimatikus proteinek vagy sejtfal-alkotórészek, mint amilyenek a poliuronsavak — eltávolítása nehéz és költséges, mivel ezek gyakran hasonló kémiai vagy fizikai tulajdonságúak, mint a kívánt termék. A nemkívánatos oldható anyagoknak a mikrobiális enzim extraktumból való eltávolítására vagy elkülönítésére számos módszer ismeretes. Ezeknek a módszereknek jó összefoglalását tartalmazza az alábbi irodalom: Methods of Enzymology, XXII. kötet, 273—287 és 476—556 oldal (W.E.Jakoby, Academic Press, N.Y., N.Y.). Itt különféle enzimtisztítási módszereket, így oldhatóságon alapuló elválasztást, fajlagos aktivitáson alapuló elválasztást és kromatográfiás elválasztásokat ismertetnek. Számtalan enzimtisztítással foglalkozó szabadalmi leírás is ismeretes. A 3 769 168 számú USA-beli szabadalmi leírásban béta amiláz adszorpcióval, mosással, majd az enzimnek egy ionos oldattal való eluálásával történő tisztítását írják le. A 3 912 959 számú USA-beli szabadalmi leírás egy hidrolitikus enzim oldat tisztítását ismerteti. A tisztítást úgy végzik, hogy az enzimet reverzibilisen megkötik egy granulált hordozóanyagot tartalmazó oszlopon, majd ezután egy pufferrel eluálják. A 3 972 777 számú USA-beli szabadalmi leírás szerint ß-galaktozidäz tisztítását úgy végzik, hogy egy savas kationcserélő gyan1 2 tán szelektív adszorpcióval megkötik az enzimet, majd egy pufferrel eluálják a ß-galaktozidázt a gyantáról. Mindegyik módszer szerint úgy járnak el, hogy a szennyeződéseket tartalmazó enzim oldatot egy olyan anyaggal kezelik, amelyik adszorbeálja vagy megköti az enzimet, majd valamilyen ionos oldat hozzáadásával eluálják a tisztított enzimet a hordozó anyagról. A 4 347 322 számú USA-beli szabadalmi leírás egy olyan kromatográfiás enzim tisztítási eljárást ír le, ahol az oldható szennyeződéseket egy ioncserélő anyagon adszorbeáltatják. A 4 106 992 számú USA-beli szabadalmi leírás szerint nyers urokinázt kiszorításos kromatográfiával, DEAE- cellulóz gyanta felhasználásával tisztítanak. A leírt módszer főként arra való, hogy a pirogén anyagokat eltávolítsa az urokinázból. Számos szabadalmi leírás olyan módszert ismertet, ahol a mikrobiális enzim extraktumokat kicsapatással tisztítják. A 3 728 244 számú USA-beli szabadalmi leírás szerint á szennyeződések kicsapatását kvaterner ammonium vegyületekkel végzik. A 3 794 562 számú USA-beli szabadalmi leírásban foglaltak szerint a szennyeződések kicsapatását polietilén-imin alkalmazásával érik el. A 4 055 469 számú USA-beli szabadalmi leírás olyan eljárást ismertet, ahol a szennyeződések kicsapatását szintetikus polielektrolitek segítségével végzik. Az 1 411 503 számú angol szabadalmi leírás szerint a szennyeződések kicsapatását kationos felületaktív szer felhasználásával végzik. Mindezek a módszerek úgy érik el a tisztítást, hogy a szenynyeződéseket kicsapják és eltávolítják, az aktív enzim pedig az oldatban marad. A nitrogén atomon legalább egy hosszú szénláncot tartalmazó kvaterner ammonium vegyületek olyan felületaktív elektrolitek, amelyek oldatban aggregátumokat vagy micellákat képesek képezni. Az ilyen vegyületeket a hidrofil kvaterner amino-csoport, és a hidrofób szénhidrogén lánc jellemzi. Sok kvaterrier ammonium vegyület mikrobaellenes szerként használható azon képességük miatt, hogy a mikroorganizmusokat inaktiválni vagy gátolni képesek. Ez a tulajdonság feltehetőleg azon alapul, hogy egy anion-kation komplex képződik a pozitív töltésű kvaterner amin és a negatív töltésű mikrobiális felület között. A kvaterner ammonium vegyületek különféle negatív töltésű makromolekulákkal, így proteinekkel is oldhatatlan anion-kation komplexeket képeznek. A kicsapás, inaktiválás, denaturálás, rediszperzió és komplexképzés mind olyan jelenségek, amelyek a proteineknek kvaterner ammonium vegyületekkel való kapcsolatából következnek. A találmány tárgya eljárás vizes oldatban lévő glükóz izomeráz tisztítására oly módon, hogy a vizes oldatot egy (I) általános képletű amin-származékkal — ahol Rt jelentése 8—14 szénatomos alkil-, benzil-, (1—4 szénatomos alkil)-ben-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
