199508. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GRF peptidek és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 199508 B jük fel a gyantán. A védőcsoport eltávolítást, semlegesítést és az aminosavak hozzáadását általában Vale és társai 4.292.313 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módon hajtjuk végre. A védőcsoport eltávolítást előnyösen a következő A táblázat szerint végezzük: 7 A táblázat Reagens Keverési idő (perc) 1. 60% TFA/2% etándiol 10 2. 60% TFA/2% etánditiol 15 3. IPA/1 % etánditiol 0,5 4. Et3N (10%) CH2C!2-ban 0,5 5. MeOH 0,5 6. Et3N (10%) CH2CI2-ban 0,5 7. MeOH (kétszer) 0,5 8. CH2C12 (kétszer) 0,5 A kapcsolást előnyösen a B táblázat szerint hajtjuk végre: B táblázat Reagens____________Keverési idő (perc) 9. DCCI 10. Boc-aminosav 50—90 11. MeOH (kétszer) 0,5 12. CH2C12 (kétszer) 0,5 13. Ac20 (3M) CH2Cl2-ban 15,0 14. CH2C12 0,5 15. MeOH 0,5 16. CH2C12 (kétszer) 0,5 Röviden, a gyanta egy grammjára számítva 1—2 millimól BOC-val védett, metilén-kloridban oldott aminosavat és 1,0 mólos metilén-kloridban oldott DCCI-nek egy ekvivalens mennyiségét reagáltatjuk 2 órán keresztül. Amikor a BOC-Arg(Tos)-t összekapcsoljuk, DMF és metilén-klorid 1:1 arányú oldatát használjuk. Bzl étert a Ser és Thr oldalláncban lévő hidroxilcsoportjának védelmére alkalmazunk. P-nitro-fenil-észtert (ONp) az Asn és Gin karboxilcsoportjának aktiválására használunk és például akkor, ha a BOC-Asn(ONp)-t egy éjszakán keresztül kapcsoljuk egy ekvivalens, DMF és metilén-klorid 1:1 arányú elegyében oldott HOBt-t használva. Az Asn és Gin amidocsoportját akkor védjük xantilcsoporttal ha DCC kapcsolást alkalmazunk az aktív észteres módszer helyett. 2-klór-benziloxi-karbonil-csoportot (2C1-Z) a L-ys oldallánc védőcsoportjaként alkalmazunk. Tos-t az Arg guanidinocsoportjának védelmére használjuk, és GIu vagy Asp karboxilcsoportját Bzl észter (OBzl) formájában védjük. A Tyr fenolos hidroxilcsoportját 2,6-diklór-benzil-csoporttal (DCB) védjük. A szintézis végén a következő felépítésű peptidet nyerjük: X'-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4) -Asn (X*) -Ser (X4) -Tyr (X2) - Arg ( X6) -Lys (X7) - -Val-Leu-G!y-Gln(X*)-Leu-SenX4)-Ala-Arg(X6) -Lys (X7) -Leu-Leu-Gln (X5) -Asp (X3) -Ile-He Ser (X4) -Arg(X6) -Gin (Xs) -Gin (X5) -Gln-Glu (X3) -Ser (Xr) -Asn (X5) -Gin (Xs) -Glu (X3) - -Arg (X6) -Gly-Ala-X8 mely képletben X1 jelentése BOC, X2 jelentése DCB, X3 jelentése benzil-észter, X4 jelentése Bzl, X5 jelentése Xan, . X6 jelentése Tos, X7 jelentése 2C1-Z és Xs jelentése -NH-gyanta hordozó. Az a-amino-csoportok blokkolására alkalmazott Xan-t részlegesen vagy teljesen eltávolíthatjuk trifluor-ecetsavas kezeléssel. Miután a végső Tyr gyököt hozzákapcsoltuk a gyantához, a BOC-t TFA és CH2C12 3:2 elegyével hasíthatjuk le. A gyantáról való felszabadítás és a maradék védőcsoportok eltávolítása érdekében a gyanta-peptid 1 grammjára számított 1,5 ml anziolial, 0,5 ml metil-etil-szulfiddal és 15 ml hidrogén-fluoriddal kezeljük a gyantához kötött peptidet másfél órán keresztül —20°C- on, majd másfél órán keresztül 0°C-on. A hidrogén-fluorid nagyvákuumban való eltávolítása után a gyanta-peptid maradékot absz. dietil-éterrel és kloroformmal felváltva mossuk, a peptidet gázmentesített 2n vizes ecetsavval extraháljuk, és a gyantáról távolítjuk el. A gyantáról eltávolított és védőcsoportjaitól megszabadított peptidet ezután 0—5%os ecetsavban mossuk és tisztítjuk, például többek között Sephadex G-50 finom gélen való szűréssel. A peptidet ezután tovább tisztítjuk preparatív vagy félpreparatív nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC), Rivier és munkatársai (Peptides: Structure and Biological Function, /1979/ 125—8) valamint Marki és munkatársai (J. Am. Chem. Soc. 103, 3178 /1981 /) módszerei szerint. A kromatográfiás frakciók összetételét gondosan HPLC-vel ellenőrizzük, és csak a megfelelő tisztaságú frakciókat gyűjtjük össze. A tisztaság szempontjából külön-külön ellenőrzött frakciókat 0,11%-os TFA-ban oldott CH3CN segítségével sózzuk ki. A főfrakciót ezután liofilizálva jutunk a kívánt peptidhez, melynek tisztasága nagyobb, mint 98%. A szintézist megismételjük klórmetilezett gyantát használva, így ugyanannak a pepiidnek a szabad sav formáját kapjuk, mint azt Rivier (J. Am. Chem. Soc., 96, 2986— 2992 /1974/) leírta. 2. példa A H-D-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn--Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-Ile--Met-Ser-Arg-G!n-Gln-Gly-NH2 képletű [ D-Tyr1 ] -hGRF-(l-32)-NH2 előállítása A fenti peptidet lépésenként állítottuk elő MBHA gyantán, Beckman 990 Peptide Synthetizert használva az 1. példában leírt módon. 8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
