199504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 199504 B A találmány tárgya közelebbről eljárás kettősszálú, RNS alapú nukleinsavszármazékok -előállítására, amelyeknek molekulamérete 50—10000 bázis. Az 1. ábra a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszármazékok HPLC gélszűrésí eluciós mintáját mutatja.. A szokásos módszerekkel szintetizált, kereskedelemben kapható poli-I.poli-C toxikus. Kutatásokat folytattunk a toxicités okának felderítésére és megszűntetésére. Nukleinsav polimereket vizsgáltunk arra nézve, hogy a rákos egerekben mennyire gátolják a rákos sejt aktivitást, másrészt menynyire károsítják íz eger csontvelő"'sejteket, es a következőket találtuk: Ha a nukleinsavpolimerek molekulamérete nagyobb, mint 13S, az ülepedési konstanssal kifejezve, a polimerek aktivak és toxikusak. Ha a nukleinsav polimerek molekulamérete az ülepedési konstanssal kifejezve 4S és 13S közötti, a polimerek aktivak, de toxicitásuk igen alacsony. Ha a nukleinsav polimerek molekulamérete ülepedési konstanssal kifejezve' kisebb, mint 4S, a polimerek se nem aktivak, se nem toxikusak. Az a tény, hogy a 4S-nél kisebb ülepedési konstanssal rendelkező poli-I.poli-C származékok inaktívak, megfelel a Declercq-féle ismertetésnek, arra vonatkozó tanulmány azonban, hogy mi az összefüggés a 'nukleinsav polimerek lánchossza és toxicitása között, mindezideig nem ismeretes. Kutatásaink során ismertük fel, hogy a nukleinsav-polimerek toxicitása jelentősen csökkenthető azáltal, hogy a poli-I.poli-C származékok molekulaméretét (lánchosszát) a meghatározott határok közé állítjuk be. Ennek megfelelően a találmány értelmében a nukleinsav származékok molekulaméretét ülepedési konstanssal kifejezve 4S és 13S közé állítjuk (azaz a polimer származék bázisainak számát 50 és 10000 közötti értékre állítjuk). Az említett határok között a lánchosszúság eloszlás maximuma rendszerint 100— 600 bázis, vagy hasonló. A „bázispár" (a továbbiakban „bp") kifejezés, amelyet általánosan a nukleinsavak molekulamérete egységeként használnak, a nukleinsavat alkotó bázisok száma formájában jelöli a nukleinsavak molekula méretét. (Például 10 bp. olyan kettősszálú polimert jelent, amely 1Ö bázisból épül fel.) A jelen leírásban nem csak kettősszálú nukleinsav polimerekről van szó, ezért a „bázisszám (bázisok száma)" kifejezést használjuk a „bp" helyett a nukleinsavak molekulaméretének jellemzésére. (így például egy „10 bázisszámú" nukleinsav polimer azt jelenti, hogy a polimerben 10 bázis található). Amikor a nukleinsavak molekulameretét kell meghatározni vagy azonosítani, általában széles körben az úgynevezett ülepedési konstanst (S érték) használják. A nukleinsavak említett- bázisszáma azonban gyors 3 folyadékkromatográfiával (HPLC) megkapható gélszürő oszlopon vagy elektroforézissel (a későbbiekben részletesebben), ahol jelzőként ismert molekulaméretű kettősszálú 5 standard DNS-eket (M13 fág-DNS fragmenseket) használunk, és a nukleinsav meghatározandó bázisszámát a kontroll bázisszáma alapján számítjuk. A makromolekulájú nukleinsavak mole- 10 kulatömegének jellemzésére mindeddig az ülepedési konstans értéket (S értéket) használták széles körben. A kereskedelemben kapható makromolekulájú nukleinsavak jellemzése S értékükkel történik. A kísérleti technikák utóbj5 bi években bekövetkezett fejlődése következtében azonban a gélelektroforézis, gélszűréses kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, stb. sokkal pontosabb eszközt biztosít a makromolekulájú anyagok molekulatömegének meg- 20 határozására, így a makromolekulájú nukleinsavak lánchosszának meghatározása lehetővé vált. Ilyen körülmények között az S értékkel való jellemzés és a lánchosszal való jellemzés közötti összefüggés problematikussá vál- 25 hat. Különösen mivel az illető nukleinsav molekuláknak az S értékkel történt jellemzés esetén megvan a saját valódi értékük, nem mindig problémamentes annak megállapítása, hogy az S értékkel megadott méret 3Q és a lánchosszal megadott méret pontosan megfelel-e egymásnak a nukleinsavak molekulatömegének jellemzése szempontjából. Ennek megfelelően a találmány szerinti nukleinsav polimerek molekulatömegének 35 megadására az S értékkel történő jellemzést is alkalmazzuk a leírásban, a nukleinsav-kémia területén szokásos módszereknek megfelelően. Mivel azonban az „S érték"-et a makromolekulás nukleinsavak molekulái össztö- 40 niegének mérése útján határozzák meg, az egész molekula tömegre (vagy az anyag molekuláris állapotára vonatkozik az anyag lánchosszának (amelyet bázisszámként jelölünk) mérete alapján történő jellemzést is megadjuk az említett „S értékkel" együtt. Ez kü- 4® lönösen azért történik így, mivel a molekulatömegeloszlás határértékeit differenciáltabban kell megjeleníteni a jelen találmánnyal kapcsolatban. g0 A találmány szerinti nukleinsav származékokként azok említhetők, amelyek az említett szintetikus nukleinsav származékok megfelelő méretűvé alakításával (láncrövidítésevei) nyerhetők. Az így megfelelő méregé tűre alakított származékoknak az alapvető szerkezete megegyezik a poli-I.poli-C szerkezetével. A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav származékokra azonban jellemző a meghatározott molekulaméret eloszlás. A találmány szerinti nukleinsavszármazékokként például a következők említhetők: — poliinozinsav.policidilsav, melynek S értéke 4—13, különösen azok, amelyekben a molekulák bázisszáma a maximális mo- 65 lekulaeloszláson belül 100—600; 4 3
