199461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oktahidro-indolizin és -pirido(1,2-a)pirimidin-propánsav-származékok előállítására
HU 199461 B (3H, s), 3,77 (3H, s), 3,84 (1H, td), 4,27 (1H, m), 4,48 (1H, d). A kristályos termék röntgen krisztallográfiája alapján a termék relatív konfigurációja a IV képlettel adható meg. 5. példa A-faktor hidrogénezése rádium felett 51,7 mg A-faktor 100 ml metanollal készült oldatához 50 mg 5% Rh/Al203 kata: lizátort adunk és a keveréket 12 óráig körülbelül 160°C-on 6,895.10*.Pa hidrogégnyomás alatt hidrogénezzük. A redukciós keveréket leszűrjük, szárítjuk, bepároljuk és fordított fázisú HPLC-vel kromatografáljuk Dupont Zorbax ODS oszlopon (9,4 mm belső átmérő, 25 cm hosszú). Az átfolyási sebesség 4 ml/ /min és a detektálás az UV tartományban 210 és 325 nm hullámhosszon történik. A mozgó fázis: A: 50% acetonitril-f0,2% hangyasav és C: 0,2% hangyasav. Az elúció programja: 20 perc C-vel, 20 perc 0—10% A-val és 15 perc 10—25% A-val. Az átfolyási sebesség 1,5 ml/frakció. A 35. és 36. frakciót egyesítve, bepárolva és liofilizálva 3,7 mg anyagot kapunk, amely a tetrahidro-A-faktor két izomerjének 1,6:1 arányú keverékéből áll. A redukció folyamán egyéb redukált termékek is képződnek, mint a tetrahidro-A-faktor izomer keverékének monometil-észterei, a tetrahidrodezoxi-A-faktor két izomer formájának keveréke és a tetrahidrodezoxi-A-faktor monometil-észtere A redukálatlan A-faktor dimetilésztere is kimutatható. 6. példa ' A58365 faktorok termelése és izolálása Az S. chromofuscus NRRL 15098 liofilizált pelletjét használjuk 50 ml sterilizált vegetatív tápközeg beoltására, amely 1% glükózt tartalmazó 3%-os triptikáz-szója tápfolyadékból áll. A beoltott tápközeget rázás közben 30°C-on 48 óráig inkubáljuk. E vegetatív tápközegeket használjuk a szaporító tápközeg beoltására a következő módon: két 2000 ml-es lombikba bemérünk 1% glükózt tartalmazó 3%-os triptikáz-szója tápfolyadékot (400 ml) és beoltjuk a vegetatív tápközeg 10—10 ml-ével. A szaporító tenyészeteket ezután 24 óráig 30°C-on inkubáljuk. Mindkét szaporító tenyészetet 100 liter termelő tápközeg beoltására használjuk fel, melynek összetétele a következő: 17 Alkotórészek Koncentráció (g per 1) „Dow Corning A" habzásgátló 0,2 Burgonya-dextrin 35 Élesztő 0,25 OM pepton1 20 CoC12.6H20 0,01 L-prolin 4 N-Z Amine A2 4 Ionmentesített víz 100 literig !) OM pepton: oldható hús-pepton, Amber Laboratories, Juneau, WI 2) N-Z Amine A: kazein enzimatikus hidrolizátuma, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, NJ. Sterilizálás előtt a tápközeg pH-ját 5n nátrium hidroxid-oldattal 7,0-re állítjuk be. Sterilizálás után a tápközeget beoltjuk a fent leírt szaporító táptalajjal és a termelő fermentálását 25°C-on 90 óráig folytatjuk. A fermentáció alatt keverés közben steril levegőt vezetünk át a tápközegen olyan ütemben, hogy a tápközeg oldott oxigéntartalmát körülbelül 30—40% levegőtelítettséggel tartsuk fenn. A tápközeg pH-ja a fermentáció alatt 8,3- ig emelkedik. Fermentáció közben a tápközeg A58365 faktor tartalmát a fentebb leírt HPLC refidszerrel vizsgáljuk. A faktorokat fluoreszcenciájuk alapján detektáljuk Schoeffel Model FS 970 spektrofluorométert használva KxC.= =327 hullámhosszon, 370 nm zárószűrővel. A termelő tápközegben 90 órás fermentációs periódus után 11,5 mcg/liter A58365 mutatható ki. A fermentációt a fentiek szerint három, egyenként 100 liter tápközeggel végrehajtva a fermentorok tartalmát tömény sósavoldattal pH 2,0-ig megsavanyítjuk. A megsavanyított teljes fermentleveleket egyesítjük és 2% „Hyflo" szűrési segédanyag hozzáadásával leszűrjük. A szűrtlé pH-ját 7,0-re állítjuk be 5n nátrium-hidroxid-oldattal. A semleges fermentléhez térfogatának 1/10 részét kitevő mennyiségben Diaion HP-20 gyantát adunk és a gyanta-fermentlé keverékét 2 óráig keverjük. A levet elválasztjuk a gyantától és 5n sósavoldattal pH 2,0-ig megsavanyitjuk. A megsavanyított fermentlevet lehűtjük és átszűrjük az inaktív csapadék eltávolítása céljából. A megsavanyított fermentlevet 6 m hosszú és 10,16 cm belső átmérőjű, 20 liter Diaion HP-20 gyantát tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlopot 60 liter 0,3%-os vizes hangyasavoldattal mossuk és az effluenst elöntjük. Ezután az A58365 faktorokat víz/hangyasav (99,7:0,3 térf.%) - acetonitril/víz/hangyasav (20:79,7:0,3 térf.%) gradienssel eluáljuk, 2 literes frakciókat gyűjtve. Az A-faktort tartalmazó 27—48. frakciót összeöntjük és vákuumban 750 ml térfogatra bepároljuk. Az elúciót 20 liter acetonitril/ /víz/hangyasav (20:79,7:0,3) eleggyel hajtjuk végre. A B-faktort tartalmazó 56—63. frakciót egyesítjük és 350 ml térfogatra bepároljuk. Az- A-faktort tartalmazó köncentrátumot 9,3X80 cm-es (5 liter) Dovex 50WX2 (H+) oszlopra visszük fel, az oszlopot körülbelül 17 liter ionmentes vízzel eluáljuk 1 literes frakciókat gyűjtve. Az A-faktort tartalmazó 9—15. frakciót egyesítjük és mintegy 200 ml-re bepároljuk. A koncentrált A-faktort (pH 2—3) átszűrjük és fordított fázisú HPLC-vel kromatografáljuk mintegy 2,5 kg (4—4,5 liter) oktade-18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
