199452. lajstromszámú szabadalom • Eljárás helyettesített dibenzo- és piridobenzazepinonok és az azokat tartalmazó gyógyászati készítményeknek az előállítására
HU 199452 B Az agykéregállományt 220—250 g testtömegű CD-COOBBS hím patkányok szolgáltatták. A homogenizálást egy Potter-Evelhjem féle készülékben végeztük Na+/Mg++ HEPES puffer jelenlétében, amelynek a pH- ja 7,4 volt (100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 20 ml HEPES) és a szuszpenziót két fátyolszöveten átszűrtük. Kötésgörbéket közvetve származtattunk le a vizsgált vegyületekre összehasonlitó kísérletekből 0,5 nM 3H-pirénzepinnel szemben, amely az agykéregállomány muscarin receptorait jelöli. A homogenizátum 1 ml-nyi mennyiségét 45 percig 30°C-on inkubáltuk jelző kötött atomcsoport (ligand) jelenlétében és a hideg kötött atomcsoport különböző koncentrációit, amelyeknél az egyensúlyt elértük, meghatároztuk megfelelő kötő kísérletekkel. Az inkubálást centrifugálással (12.000 ford/perc) fejeztük be szobahőmérsékleten, amelyhez Eppendorf-féle mikrocentrifugát használtunk. A keletkezett pel leteket 2X1,5 ml telített konyhasóoldattal mostuk a szabad radioaktiv anyag eltávolítása érdekében, majd a végső pelleteket szikkadni hagytuk. A pelleteket tartalmazó csövek végét levágtuk és 200 pl szövetszolubilizáló anyagot (Lumasolve, Lumac) adtunk hozzá, majd éjszakán át állni hagytuk. A radioaktivitást azután határoztuk meg, miután 4 ml folyékony szcintillációs elegyet (Dimilume/toluol 1:10 tf/tf, Packard) adtunk hozzá. A próbákat háromszoros vagy négyszeres ismétlésben hajtottuk végre és a nem-fajlagos kötést a radioaktív kötésként határoztuk meg vagy befogtuk a pelletbe, amikor az inkubációs közeg 1 pM atropin-szulfátot tartalmazott. A nem-specifikus átlagolt kötés kevesebb, mint 30% volt. A Kő-értékeket (diszszociációs állandókat) nem-lineáris regressziós analízissel kaptuk egy kötőhely-model alapján TOPFIT-farmakokinetikus programcsomaggal (G. HEINZEL, „Pharmacokinetics during drug Development: Data Analysis and Evaluation Techniqes" Eds. G. BOLZER and J.M. VAN ROSSUM; p. 207, G. Fisher, New York, 1982) a radioligand helyeltolódásra való korrekció után a Kd=IC50(1-+-*C)*Kd egyenlet szerint, ahol *C és *Ko az alkalmazott radioligand koncentrációját és disszociációs állandóját képviseli. 5 Az M2 muscarin-hatást úgy határoztuk meg, hogy tanulmányoztuk a 3H-NMS-nek az agykéregállomány-homogenizátumból való elmozdulását az M, muscarin-hatás vizsgálatára leírt módon. In vivo vizsgálat gyomorsipollyal ellátott éber kutyánál 5 Beagle-fajta, 15—22 kg tömegű hím kutyával végeztünk vizsgálatokat, amelyek mindegyikébe gyomorsipolyt építettünk be. Gyomorsavkiválasztást idéztünk elő 100 mg/kg 2-dezoxi-D-glukózzal (2-DG), amelyet 10 perc alatt vezettünk be intravénásán az állatokba és a kivált gyomornedvet 15 perces időközökben gyűjtöttük össze. A savtermelés 45 perccel és 2-DG infúziójának a kezdete után csúcsot ért el (5,4 mEg/15 perc; a maximális reagálás 75%-a hisztaminhoz) és utána fokozatosan csökkent olyan szintre, amely a csúcs.reagálás körülbelül 40%-ának felelt meg (3 órával a 2-DG után). Minden egyes mintának megmértük a térfogatát (0,1 ml pontosságig) és a savasságát (1 ml minta 7 pH-ra történt beállítása 0,1 normál NaOH-val ITT Radiometer PHM 62 automatikus titráló segítségével). Meghatároztuk a pepszintartalmat mindegyik 15 perces mintánál 0,1 ml gyomornedvre (1:20 arányban hígítva 0,1 normál HCl-el) a hemoglobin digeráló módszer felhasználásával, amelyet Anson írt le a J. Gén. Phys. 22 (1978) 79 irodalmi helyen és az eredményt mU Ansonban fejeztük ki. A vegyületeket intravénásán fecskendeztük be halmozott módon, az egyes adagokat 15 perces időközökben adtuk be a csúcsreagálás elérésétől számítva. Minden adagszintnél megmértük a szívsebességet kardiotachométerrel és a pupillaátmérőt fény alkalmazása mellett feljegyeztük. Az 50%-os savgátlást (ED50 és 95%-os biztonsági határok), a pepszintermelést és a legnagyobb gátlást (I max) az adatok frákcionális lineáris transzformációjával kaptuk: D/I=aD+b, ahol D= antagonista adag, I=sav- vagy pepszintermelés %-os gátlása; I max=l/a; ED50=b/a. (Hirschowitz B.I. Am. J. Physiol. 216: 487— 489 1969). A szívsebességet percenként 50 szívverésre növelő adagokat (ED50 és azok 95%-os biztonsági határait) a hatással öszszefüggő adag értékének a lineáris regreszsziós analízisével határoztuk meg. 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 4
