199433. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cinnolin-származékok és hatóanyagként e vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 199433 B get naponta egy alkalommal vagy több — például 2—4 — részletre elosztva adhatjuk be. A hatóanyagok tényleges dózisa a kezelés időtartamától és az adott vegyület maximális aktivitásától függően változik. A hatóanyagokat rendszerint dózisegységek formájában készítjük ki; egy dózisegység körülbelül 5—250 mg hatóanyagot tartalmazhat szokásos gyógyszerészeti hordozó-, hígító-, kötő-, konzerváló-, stabilizáló-, ízesítő- és/vagy egyéb adalékanyagokkal együtt. A felhasználható gyógyszerészeti adalék- és segédanyagokat a 3 755 340 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás részletesen ismerteti. Az (I) általános képletű vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények adott eset'ben egy vagy több további ismert gyógyhatású anyagot is tartalmazhatnak, illetve más ismert gyógyhatású anyagokkal együtt is adagolhatok. Az (I) általános képletű vegyületek biológiai aktivitását a következő módszerekkel vizsgáltuk: A vegyületek szorongásgátló hatását a Pharmacology, Biochemistry and Behavior 12,819—821 (1980) közleményben leírt módszerrel értékeltük. A vizsgálatot a következőképpen végeztük: 200—220 g testtömegű hím Wistar patkányoktól a kísérlet elvégzése előtt 48 órán át megvontuk a vizet és 24 órán át megvontuk az élelmet. A patkányoknak orális úton, szondán át 5 ml/kg hatóanyag-oldatot adtunk be, ami 0,20, 0,39, 0,78, 1,56, 3,125, 6,25, 12,5, 25 és 50 mg/testtömeg kg hatóanyag-mennyiségnek felelt meg. Egyes esetekben a hatóanyag oldatát intraperitoneálisan adtuk be. A kontroli-kísérletekben az állatoknak orálisan hordozóanyagokat (kezeletlen kontroll), illetve 18 mg/kg klór-diazepoxidot (kezelt kontroll) adtunk be. Az állatokat véletlenszerűen választottuk ki az egyes kezelésekhez. Ezután az állatokat 1 órára viszszahelyeztük a ketrecbe, majd az állatokat kiemeltük a ketrecből, és hátsó lábaikat Signa elektród-géllel (gyártja a Parker Laboratories cég, Orange, New Jersey) kentük be. Intraperitoneális kezelés esetén a várakozási idő 30 perc volt. Ezután a patkányokat itatócsővel szembenéző helyzetben visszahelyeztük a ketrecbe. Az állatokat 5 percig inni hagytuk (ezalatt az állatok körülbelül 20-szor nyalták meg az itatócsövet), majd az állatokra 0,5 mA erősségű áramütést mértünk. Azokat az állatokat, amelyek a kísérlet első 5 perce alatt nem reagáltak megfelelően, eltávolítottuk a kísérletből. Ezután az állatokat további 3 percig a ketrecben tartottuk, és ezalatt az idő alatt minden huszadik itatócső-nyalást 0,5 mA erősségű áramütéssel kapcsoltunk össze. A kísérleti időszakokat automatikusan indítottuk, számláltuk és fejeztük be, és feljegyeztük a nyalások és az áramütések számát. A vizsgált vegyület aktivitásának értékelése során Student-féle t-próbá7 val összehasonlítottuk a vizsgálandó vegyülettel kezelt, valamint a kezeletlen kontroli-csoportba tartozó állatokra gyakorolt áramütések átlagos számát. Az állatok által elviselt áramütések számának növekedése azt jelzi, hogy az adott hatóanyag szorongásgátló aktivitással rendelkezik. Az eltérést akkor tekintettük statisztikailag szignifikánsnak, ha a meghatározott p érték 0,05-nál kisebb Volt. A vegyületek szorongásgátló hatását az European Journal of Pharmacology 78, 315— 322 (1982) közleményben ismertetett eljárással is megvizsgáltuk. A kísérleteket a következőképpen végeztük: 150—250 g testtömegű hím Sprague-Dawley patkányok agykérgéből Braestrup és Squires módszerével (Proceedings of the National Academy of Science USA 74, 3805 (1977) ) oldott mitochon’drium-synaptosoma (P2) frakciót készítettünk. A preparátumot 100 millimór nátrium-kloridot tartalmazó, 7,4-es pH-értékű, 50 millimólos trisz-citrát pufferoldattal centrifugálás közben kétszer mostuk. A preparátumok specifikus flunitrazepam-kötö képességét Wastek és munkatársai (European Journal of Pharmacology 50, 445 (1978) ) módszeréhez hasonlóan vizsgáltuk. 2 ml térfogatú mintákat készítettünk, amelyek 0,2 nM 3H-flunitrazepamot (radioaktivitás: 84 Curie/mmól) és 10 mg friss súlynak (=0,2 mg fehérje) megfelelő mennyiségű sejtmembránt tartalmaztak. Hordozóközegként 100 millimól NaCI-t tartalmazó 50 millimólos trisz-citrát pufferoldatot. (pH=7,4) használtunk. A mintákhoz 20 pl hatóanyag-oldatot adtunk; oldószerként 95%-os etanolt használtunk. Á kontroli-vizsgálatokban a mintákhoz csak 20 pl 95%-os etanolt adtunk. A nem-specifikus kötődést 2,5 mmól clonazepam vagy 0,5 pmól flunitrazepam jelenlétében határoztuk meg. A mintákat 90 percig 0°C-on egyensúlyba hagytuk jutni, majd szűrtük és öblítettük. A vizsgálatokat háromszor ismételtük meg. Ezután D.B.Bylund módszerével (Receptor Binding Techniques; Society for Neuroscience (1980)), az adatok logaritmikus transzformálásával meghatároztuk azt a hatóanyag-koncentrációt (1C50), amely a hatóanyagmentes kontrolihoz viszonyítva 50%-os 3H-flunitrazepam-kiszorítást eredményez. A hatóanyagokat körülbelül 0,05— 500 nanomólos koncentrációban vizsgáltuk. Ebben a vizsgálatban a szorongásgátló hatást a flunitrazepam kiszorítása (ilyen hatás lép fel például a benzodiazepin-származtkoknál) vagy a kötődés fokozása (ilyen hatás lép fel például cartazolát és tracazolát esetén) jelzi. A vizsgált (I) általános képletű vegyületek egyik vagy mindkét fent ismertetett kísérletben szorongásgátló hatást mutattak. A patkányokon in vivo körülmények között végzett vizsgálatokban a hatóanyagokat akkor minősítettük hatásosnak, ha azok intraperitoneális vagy orális adagolás esetén 50 mg/ 8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
