199391. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-guanidino-szubsztituált aminosavszármazékok előállítására
HU 199391 B A fenti módon kapott köztitermékekből az alábbiak szerint állíthatók elő a biológiailag aktív LHRH-analógok. 4. példa 4,9 g Boc-glicint 50 ml etanol és 50 ml desztillált víz elegyében oldunk. Az oldat pH-ját vizes cézium-hidrogén-karbonát-oldattal 7-re állítjuk. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk. Nagy vákuumban 18 órán keresztül szárítjuk a maradékot, majd 150 ml vízmentes dimetil-formamidban oldjuk. 25 g klór-metilezett polisztirol—1% divinil-benzol gyantát (Merrifield) adunk hozzá (25 mmól kloridnak felel meg). Az elegyet 50°C-on 24 órán 7 keresztül rázatjuk, szűrjük, a gyantát egymást követően dimetil-formamiddal, vízzel és etanollal mossuk. A gyantát vákuumban 3 napon át szárítva 28,34 g Boc-Gly-O-gyan- 5 tát kapunk. 5. példa Beckman 990 peptid-szintetizátor reakcióedényébe 7,29 g (5,5 mmól) Boc-Glÿ-0-gyan- 10 tát viszünk, melyet száraz Boc-GlyOH-cézium-só és klór-metil-polisztirol—1% divinil-benzol ekvimoláris mennyiségeinek reagáltatásával állítunk elő. A szintézis programm segítségével egymást követően aminosavakat 15 adunk a gyantához, a következők szerint: 8 1. lépés mosás CH2Gl2~nál 1-szer 1,5 perc 2. lépés védőcsoport eltávolítás 50% CF3COOH/CH2CI2 1-szer 1,5 perc 3. lépés védőcsoport eltávolítás 50% CF3COOH/CH2CI2 1-szer 30 perc 4. lépés mosás CH2Cl2_nál 3-szor 1,5 perc 5. lépés 10% trietil-amin/CH2Cl2 2-szer 1,5 perc 6. lépés mosás CH2Cl2~nál 3-szor 1,5 perc 7. lépés N^Boc-aminosav oldat 1-szer adagolás 8. lépés NjN’-diciklohexil-karbodiimid 1-szer adagolás 9. lépés CH2C12-os öblítés, az öblitőszer leŐntése nélkül, kapcsolás 1-szer kapcsolási reakció 2 dra 10. lépés CH2CI2-OS öblítés, adagolás 1-szer 1,5 perc 11. lépés mosás CH2Cl2-nál 3-szor 1,5 perc 12. lépés mosás etanollal 3-szor 1,5 perc 13. lépés mosás CH2Cl2-nál 3-szor 1,5 perc Az 1 —13. lépések alatt egy aminosav kapcsolási ciklusa játszódik le, a reakció lejátszódását Kaiser E. és munkatársai [Anal. Biochem. 34, 595 (1970)] niuhidrines eljárásával ellenőrizzük. A gyantát egymást követő lépésekben 2,0— 2,5 mól feleslegben lévő aminosavakkal és DCC-vel kapcsoljuk. Ennek megfelelően, a gyantát az egymást követő kapcsolási ciklusokban 3,01 g Boc-Pro-OH-nal, 5,99 g Boc-Arg(tozil)-OH-nal, 3,49 g Boc-Leu-OH.H20-nal, kezeljük. Ekkor a kapott tetrapeptid-gyantát kisebb adagokra osztjuk. Egy 1,0 g-os adaggal tovább folytatjuk az alábbi aminosavakkal a kapcsolási ciklusokat: 0,456 g Boc-D-Dia-OH-toluolszulfonát 0,44 g Boc-Tyr(2,6-diklór-benzil)-OH, 0,375 g Boc-Ser(benzil)-OH, 0,315 g Boc-D-Nal(2)-OH, 0,35 g Boc-D-p-F-Phe-OH, 0,275 g Boc-L-prolin és 2,5 ml ecetsavanhidrid. A gyantát a reakcióedényből eltávolítjuk, diklór-metánnal mossuk és vákuumban szárítjuk. 1,66 g védett polipeptid-gyantát kapunk. A védett pepiidet szobahőmérsékleten 24 órán át tartó, 50 ml, 0°C-on ammóniával telített metanollal végzett kezeléssel választ- 4g juk le a gyantáról. A gyantát leszűrjük és egymást követően metanollal és dimetil-formamiddal mossuk. A szűrletből az oldószert vákuumban eltávolítva 0,9 g védett peptidet kapunk, sárga olaj formájában. 50 A védőcsoportokat 10 ml vízmentes cseppfolyós hidrogén-fluoriddal 1 ml anizol jelenlétében, Kel-F reakcióedényben 0°C-on 30 percen át tartó kezeléssel távolítjuk el. A hidrogén-fluoridot vákuumban ledesztil- 55 láljuk, és a maradékként kapott N-Ac-L-Pro- D-p-F-Phe-D-Nal (2) -Ser-Tyr-D-Dia-Leu-Arg -Pro-GlyNHj—hidrogén-fluorid-sót éterrel mossuk. A maradékot ezután jégecettel extraháljuk. Az ecetsavas extraktumot liofilezgg ve 0,5 g nyersterméket kapunk. A nyers peptidet vízben acetát-formában lévő Ag3X gyantával (gyengén bázikus tercier amin gyanta) töltött oszlopon átvezetve acetátsóvá alakítjuk. Az eluátumot liofilezve 0,5 g nyers peptidet kapunk, acetátsó formájában, fehér szilárd anyagként. 5
