199301. lajstromszámú szabadalom • Eljárás segédanyagként ciklopeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
3 HU 199301 B 4 és agonistái, valamint a kalcitonin és agonistái esetére mutattak ki. Példák t. A ciklopeptidek halasa az LIIRH (Gondadorelin) és az LIIRH agonisták (Buzerelin) nazális és rektális felszívódására a következő módon. mutatható ki: 60 'g testtömegű nőnemű patkányokat 10 l. E. lószérum-gonadótropinnal (PMSG) élőké-* zelünk (1. nap 9:00 óra) a tüsző stimulálására. Az előkezelés utáni harmadik napon a spontán 14:00 óra körül fellépő ovulációt fenobarbitállal végzett injekcióval (4 mg/állat i.p. 13:00 órakor) elősegítjük. A vizsgálandó anyaggal végzett kezelés (például LHRH vagy Buzerelin intranazális adagolása fiziológiailag alkalmas puffer oldatban pH = 3,0-7,5 között 2-20 mikroliter térfogatban, kúpok rektális alkalmazása, stb.) 13:30 történik. Ez a kezelés dózistól függően kiváltja az ovulációt. A következő kísérleti napon (negyedik nap) 9:00 az állatokat elöljük, mindkét petevezetéket preparáljuk és Patentblau színezékkel festjük, majd sztereo mikroszkóppal megszámoljuk a petesejtek számát (a vizsgálandó anyagok ovulációs hatása). A vizsgálandó anyagok nyálkahártya felületén történő felszívódásának növekedését úgy állapítjuk meg, hogy összehasonlítjuk az ovulációra gyakorolt hatásukat például 0,001-0,05 mól Bacitracin hozzáadásával és anélkül. Ugyanebben a kísérleti elrendezésben a szérumban egy órával a kezelés után mért luteinizáló hormon <LH) dózisfüggö növekedését is alkalmazhatjuk, mint a hatás paraméterét (Sandow J., von Rechenberg W. és Jerzabek G. (1976): The effect of LHRH, prostaglandins and synthetic analogues of LHRH on ovarian metabolism. Europ. J. Obstetr. Gynec. Repród. Biol. 6, 185-190). Azt tapasztaltuk, hogy 8 mikrogramm LHRH fiziológiás konyhasóoldatban 0,1% zselatinnal ebben a kísérleti elrendezésben ugyanakkora ovulációs hatást fejt ki, mint 2 mikrogramm LHRH 0,001 mólos Bacitracin oldatban. Ugyanezt a hatást tapasztaltuk továbbá 0,001 mól Kolisztin jelenlétében az LH- felszabadítás vizsgálatakor. Ugyanis 80 ng Buzerelin ovulációra gyakorolt hatása fiziológiás konyhasó oldatban 0,1% zselatinnal ebben a kísérleti elrendezésben megfelelt 20 ng Buzerelin hatásának 0,001 mól Bacitracin ol- * dalban. A felszívódás növekedése abban a vizsgálatban is egyértelmű, amelyet a Buzerelin általi LH-felszabaditás meghatározásával végeztünk 0,001 mól Bacitracin' jelenlétében. Itt a felszívódás több mint háromszorosára növekedett. 2. Egy másik módszer annak kimutatására, hogy a hatás a meg növekedett felszívódás miatt megnövekszik, például az LH-fel- 4 szabaditás meghatározása himnemü patkányoknál (100 g testtömeg, uretán narkózisban). Itt a hormonfelszabadítást 6-7 órával a kezelés után hasonlítjuk össze (például a .vizsgálandó anyagokat fiziológiás konyhasóoldathan Bacitracin, Polimixin B vagy hasonló ciklopeptidek hozzáadásával és anélkül nazálisán vagy rcktálisari alkalmazzuk). Azt találtuk, hogy mind a Bacitracin, mind a Kolisztin és a Polimixin B (0,01 mólnyi) 10 ng Buzerelin hatását 3,3-14-szeresére növeli, a görbe alatti területtel mérve. . Azonos modellben, ha a patkányokat Buzerelin kúppal rektálisan kezeljük, az ovuláció Bacitracin hozzáadása nélkül 400 ng dózisnál következik be, mig Bacitracin hozzáadásával már 50 ng Buzerelin ovulációt vált ki.' 3. A ciklopeptidek hatását a GHRH analógok nazális felszívódására a kővetkező módon vizsgáljuk: Az LHRH ovulációs hatására ismertetett modellben a PMSG-vel végzett előkezelés utáni harmadik napon vizsgálhatjuk a növekedési hormon (Growth Hormone, GH) felszabadulását. A GH szérumban történő meghatározását a (például nazális vagy rektális) kezelés után 15-120 perccel speciális Radioimmunoassay-vel végezzük. Azt találtuk, hogy Bacitracin nélkül 40 mikrogramm i.n. (DAla25-GRF29-amid hatása ugyanakkora, mint 20 mikrogramm dózis 0,001 mól Bacitracin hozzáadásával tapasztalható hatása. Ugyanezt az eredményt tapasztaltuk más GHRH-agonistákkal is, például (DAla2), NLeu27/GRF-29-amiddal és géntechnológiáikig előállított GHRH-származékkal (Leu27, Gly45) GHRH (1-44). 4. A ciklopeptidek hatását az ACTH (kortikotropin) és ACTH-analógok felszívódására himnemú patkányokon vizsgáltuk (100 g testtömeg) pentobarbitálos vagy éteres narkózisban végzett kezelés után. A hatás paramétereként a szérumban meghatároztuk a kortikoszteron felszabadulást speciális radioimmunoassay-vel. Azt tapasztaltuk, hogy például ACTH-analóg alzaktiddal (ACTH-17) 5 mikrogramm dózisban nazálisán végzett kezelés után 0,01 mól bacitracin jelenlétében a kortikoszteron felszabadulás 3 órán keresztül ötszörösére növekszik. 5. A ciklopeptidek hatását kalcitonin és kalcitonin-analógok (például Salmon kalcitonin) felszívódására himnemú patkányoknál vizsgálhatjuk, amelyek 100 vagy 200 g testtőmegűek. Például úgy, hogy Salmon kalcitoninnal végzett intranazális kezelés után meghatározzuk a szérum kalciumkoncentrációját 1-6 órával kezelés után. Azt tapasztaltuk, hogy 0,6-1,2 mikrogramm Salmon kalcitonin hatása 0,01 mól bacitracin hozzáadása után 4-6-szorosra növekszik. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
