199191. lajstromszámú szabadalom • Immunológiai eljárás herbicidek kimutatására
199191 utóbbi időben az enzim-immuno-assay módszer (EIA) teret hódított a radioimmunoassay (RIA) rovására. Az előbbi esetén a radioaktív antigén helyébe egy enzim-antigén-konjugátunT lép, amely a mintában lévő antigénnél versenyez majd az antitest szabad kötési helyeiért. Az említett kompetitiv (vetélkedő) EIA teszt során az enzimmel jelzett antigén meghatározott mennyisége versenyez a mintában lévő antigénnel az antitest kötési helyeiért, amelyek adszorpció „révén vagy kovalensen hordozó felületen, például polisztirol-felületen rögzítve vannak. Ha a mintában kevés az antigén, a hordozó sok enzim-tracert köt meg (nagy szubsztrátum-fogyasztás), ha viszont a mintában sok az antigén, csak kevés enzim-tracer rögzül a hordozón (kis szubsztrátum-fogyasztás). Az enzim-tracer kötésének a gátlása tehát a minta antigén-koncentrációjának függvénye. A meg nem kötött enzim-tracer lemosása után a szubsztrátum-fogyasztás alapján a kötött, enzimmel jelzett antigén részaránya és ezzel a minta antigén-koncentrációja meghatározható. Az enzim-tracer kötött mennyiségét a reakcióba lépett (fogyasztott) szubsztrátum (optikai) abszorpciója alapján határozzuk meg. A fenti technikával számos peszticid anyagra fajlagos antitestek képződését váltották ki, majd immuno-assay módszereket fejlesztettek ki a mérgező anyagok gyors, olcsó és nagyon fajlagos kimutatása céljából. Gyakran azonban előfordul, hogy az immuno-assay keresztreakciók következtében nem teszi lehetővé az anyag egyértelmű azonosítását és mennyiségi meghatározását. Keresztreakción azt a jelenséget értjük, hogy az antitestek különböző szerkezetű molekulákban azonos funkciókat ismernek fel és ezért ezeket a különböző molekulákat egy hatástani osztályba sorolják, azaz nem tu ónak különbséget tenni közöttük. Ez az effektus igen jellemző a kis antigén-molekulákra, mert ezeket hordozó mátrixhoz (proteinhez) kell kapcsolni, így csak a hordozó molekula által el nem fedett rész, nem az egész antigén-molekula működik felismerési területként. Ha két különböző szerkezetű molekulának ezen szabad, hozzáférhető része hasonló felépítésű, az immuno-assay nem tudja megkülönböztetni őket. Másrészt sok esetben a keresztreakció éppenséggel kívánatos, mert így nemcsak az az antigén mérhető, .amellyel az antitestet előállították, hanem a hasonló kémiai szerkezetű, illetve biológiai hatású anyagok is meghatározhatóvá válnak. A keresztreakciók tudatos kihasználása révén különböző, de egy hatástani osztályba tartozó anyagok egyetlenegy teszttel határozhatók meg, ami igen értékes az eddig fel nem derített vegyületek toxikológiai megítélése szempontjából. Az állatkísérletek és bioassay kísérletek mennyisége a legszükségesebbre redukálható, mert az ökotoxikológiai szempontból eddig nem vizsgált ve-3 gÿületek esetleges veszélyessége már a fent említett hatástani besorolás révén válik felismerhetővé. A találmány feladata olyan immunológiai kimutatási eljárás kidolgozása volt, amellyel triazin-herbicidek és kémiailag hasonló szerkezetű, illetve hasonló biológiai hatású vegyületek mint egy hatástani osztályba tartozó anyagokként natározhatók meg, de másrészt az egyes vegyületek egyértelmű azonosítását még bonyolult elegyek esetén is lehetővé teszi. A fenti feladatot immunológiai eljárással oldottuk meg, amellyel (I) általános képletű vegyületek határozhatók meg. Az (I) általános képletben R1 jelentése 1—4 szénatomos alkilaminocsoport, Rz jelentése 1—4 szénatomos alkilaminocsoport, azidocsoport vagy alkilcsoportként 1—4 szénatomot tartalmazó alkoxialkilaminocsoport és R3 jelentése halogénatom vagy l—4 szénatomos alkoxi- vagy alkiltiocsoport. A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy egy (I) általános képletű vegyületet az R1 vagy R2 vagy R3 szubsztituensével mátrixhoz kapcsolva az (I) általános képletű antigén-vegyület molekulájának csak egy részét tesszük hozzáférhetővé, majd laboratóriumi állatok immunizálása révén a molekula hozzáférhető részére különösen fajlagos, A, B vagy C jelű antitestet hozunk létre, és az (I) általános képletű vegyület kimutatására a vegyületet vélhetően tartalmazó mintát az említett A, B és C antitestek közül egyszerre vagy különböző sorrendben egymásután legalább kettővel reagáltatjuk, és az antigén-antitest-kötés alapján az (I) általános képletű vegyületet mennyiségileg és minőségileg meghatározzuk. Az eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint az immunológiai vizsgálathoz az A, B és C antitesteket vizsgálati sorozatokban alkalmazzuk az alábbi sorrendben: 1. sorozat: ABC 2. sorozat: B C A 3. sorozat: C A B. A meghatározandó anyagot tartalmazó mintát előnyösen külön-külön reagáltatjuk az antitestekkel. Ez úgy lehetséges, hogy a vizsgálandó oldatot pipettával az antitesttel kibélelt reakcióedénybe, illetve mikrotiterlemez lyukaiba juttatjuk. Előnyös az is, ha a vizsgálandó mintát először a sorozat első antitestével reagáltatjuk, utána a reakcióba nem lépett maradékot elválasztjuk és azt a sorozat következő antitestével érintkeztetjük. Speciális esetekben a találmány szerinti eljárás alkalmazása során előnyös lehet, ha a laboratóriumi állatokból nyert szérum, illetve antitesteket termelő limfociták feldolgozása során a hibridoma-technika segítségével monoklónális antitesteket nyerünk, és ezeket alkalmazzuk antitestként az eljárásban. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
