199191. lajstromszámú szabadalom • Immunológiai eljárás herbicidek kimutatására
199191 A találmány szerinti immunológiai teszt lehetővé teszi, hogy az adott (I) képletű vegyület mellett a keresztreakciók révén hasonló szerkezetű vegyületeket, valamint ezektől szerkezetben különböző, de biológiailag azonos irányú hatással és hasonló kötődési vonzalmakkal rendelkező vegyületeket is meghatározhassunk. Az antigén-antitest reakció immunológiai kimutatását előnyösen olyan antigénnel végezzük, amely radioaktív jelzéssel ellátott, vagy enzimhez, fluoreszkáló anyaghoz vagy elektromos jeleket kibocsátó anyaghoz (bioszenzorhoz) kapcsolt. A mintában lévő antigént és a jelzett, illetve kötött antigént versenyeztetjük az antitest kötési helyeiért, utána az antitesthez hozzá nem kötött, szabad reagenst elmossuk, és a radioaktív sugárzás, az optikai abszorpció, a fluoreszcencia sugárzás vagy az elektromos jel megmérésével meghatározzuk az oldat antigén-koncentrációját. A találmány szerinti immunológiai eljárás lehetővé teszi, hogy egy bizonyos hatástani osztályba tartozó anyagokat kimutassunk, ugyanakkor a hatástani osztályba tartozó különböző anyagokat külön-külön is azonosítjuk. A találmány szerinti teszt gyors, igen fajlagos és nem költséges, és a környezet-elemzés során szükségessé váló nagyszámú minta elemzésével megbirkózik; az utóbbi a hagyományos elemzési módszerekkel — automatizálásuk ellenére — nem volt lehetséges. Az eljárás kidolgozása során arra törekedtünk, hogy toxicitás szempontjából eddig nem vizsgált vegyületek hatástani csoportokba való sorolás révén ökológiai szempontból felmérhetők legyenek. A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük. 1 1. példa Az alábbiakban az (I) általános képletű vegyületek egyik jellegzetes képviselője, az atrazin molekula egy-egy oldalára fajlagos A, B és C jelű antitestek előállítását, és az ezekkel végzett immunológiai teszt végrehajtását írjuk le. Az A jelű antitest az atrazin-molekula (II) részképletű oldala ellen irányul főleg. Előállításához először az ametryn triazin-származék metiltioéter-csoportját szulfoxidáljuk, majd az így módosított ametrynt közvetlenül a szarvasmarha szérumalbuminhoz kapcsoljuk. A B jelű antitest főleg az atrazin (III) részképletű oldalára fajlagos; előállításához a simazin nevű triazin-származék etilaminocsoportjainak egyikét kapcsoljuk a proteinhez. a karbodiimid módszer segítségével. Végül az atrazin (IV) részképletű oldalát előnyben részesítő C jelű antitestet úgy állítjuk elő, hogy a propazin nevű herbicid hatóanyagot az egyik izopropilamin-csoportján keresztül hordozó mátrixhoz kapcsoljuk. 4 5 A fentiek szerint előállított konjugátumokat az A, B és C antitestek előállítása céljából laboratóriumi házinyulakra juttatjuk injekcióval, majd az antitesteket az immunizált állatok szérumából ismert módon kinyerjük, illetve affinitás-kromatográfiásan tisztítjuk, a szubsztituensek alapján. A kapott antitesteket polisztirol felületű mikrotiterlemezek lyukfalain adszorbeáltatjuk, az alábbiak szerint: az antitestet karbonát-pufferben (Na2C02/NaHC03; 50 mmól/ /I, pH 9,6) feloldjuk és az oldatból 0,25— 0,25 ml-t a mikroliterlemez lyukaiba pipettáink. A lemezeket szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül inkubáljuk, majd TBS-pufferrel mossuk. A nedvesség eltávolítására a lemezeket jól kirázzuk, majd száraz helyen —20°C-on tároljuk. Elemzés céljából a megvizsgálandó vizes minta 180 pl-jét (a mintában a meghatározandó anyag koncentrációja 1 jLtg/1 és 200 mg/1 közötti) a lyukakba töltjük, majd 50 pl enzimtracert (az antitestnek megfelelő triazin-származék és alkálikus foszfatáz konjugátumát) adjuk hozzá. Amennyiben az A antitestet alkalmazzuk, az enzimet ametryn-nel kapcsoljuk össze, míg B, illetve C antitest esetén simazint, illetve propazint alkalmazunk. A mikrotiterlemez vízszintes irányú rövid rázásával az oldatokat összekeverjük. A lemezt 20°C-on 1 órán át inkubáljuk, majd a lemezt TBS-pufferrel lemosva (50 mmól/i trisz(hidroximetil)-aminometán, 1 mmól/1 MgCl2, 50 mmól/1 NaCl, pH 7,8, sósavval, 0,05% polioxietilén-szorbitán-monooleát) az antitestek kötéshelyeihez hozzá nem kötött összes molekulát eltávolítjuk. A kötött enzimtracer mennyiségi meghatározására mindegyik lyukba 125 pl foszfatáz-szubsztrátum-oldatot töltünk (1 mg p-nitrofenil-foszfát/1 ml karbonátpuffer). Az enzimes reakció 20°C-on is lezajlik, de melegítéssel meggyorsíthatjuk. Az egyes lyukakban lévő oldat optikai abszorpcióját merőlegesen sugárzó fotométerrel mérjük 405 nm hullámhosszon. Amennyiben az érzékenységet fokozni kívánjuk, a lemezt 4°C-on egy éjszakán át inkubáljuk. Tudnunk kell azonban, hogy különleges tiszta vegyszerek, eszközök, helyiségek nélkül a ppt-tartományban reprodukálható eredmények nem érhetők el. A mintában lévő antigén koncentrációjának kiszámítása az alábbi elgondolásokon alapul. Az enzim-tracer azokon a szabad kötéshelyeken kötődik, amelyeket a mintában lévő antigén meghagyott. így, ha a mintában sok az antigén, kevés hely marad az enzimmel jelzett antigénnek, míg kis koncentrációjú minta esetén sok enzimes antigén tud kötődni. A megkötött enzim-tracer mennyisége tehát a minta antigén-koncentrációjának függvénye. Ez a mennyiség mérhetően kifejlődik az átalakult szubsztrátum optikai abszorpciójában (színreakció színtelentől sárgára). 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
