199160. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GnRh antagonista ciklusos dekapeptidek előállítására
199160 mok nem tartalmaznak védőcsoportot. Előnyösen alkalmazható védőcsoport a Tos-csoport. Az X2-X9 oldallánc védőcsoportokat úgy kell megválasztani, hogy ezek stabilak legyenek azon reakciókörülmények között, amelyet a reakció minden egyes lépésében az a-amino-védőcsoportok (előnyösen Boc-csoportok) eltávolítására alkalmazunk. A védőcsoportoknak nem szabad lehasadniuk a ciklizálás reakciókörülményei között, de a kívánt aminosav szekvenciát tartalmazó peptid szintézisének befejezése után olyan reakciókörülmények között legyenek eltávolíthatók, amelyek a peptid szerkezetét nem befolyásolják. Az Xs védőcsoportok néhány esetben olyanok legyenek, hogy eltávolításuk lehetséges legyen az X6 védőcsoport eltávolítása előtt. Amennyiben X9 jelentése -0-CH2-(gyanta hordozó), a polisztirol gyanta számos funkciós csoportja közül az észter-csoport értendő ez alatt. Amennyiben X9 jelentése -NH- (gyanta hordozó), az R10 csoportot amidkötés köti a BHA gyantához vagy MBHA gyantához. A ciklizálást a lineáris peptiden úgy is végre hajthatjuk, hogy a peptidet a peptid-gyanta részeként ciklizáljuk. Amennyiben a ciklizálást diszulfid-kötésen keresztül hajtjuk végre, a teljesen védett peptidet a hidroxi-metilezett vagy klór-metiiezett gyantáról a szakirodalomban ismert módon, ammonolízis segítségével hasíthatjuk le, és a valamennyi funkciós csoportján védőcsoportot tartalmazó közbenső terméket kapjuk termékként, amelyet azután megfelelően ciklizálhatunk és védőcsoportjait eltávolíthatjuk; más módszer szerint a peptid benzhidril-amin-gyantáról való hasítását és a védőcsoportok eltávolítását egy lépésben 0°C-on hidrogén-fluoriddal végezzük (HF). Bizonyos kísérletek szerint a ciklizáló végrehajtható részlegesen védő csoport-mentesített pepiiddel is, amely még a gyantához kötött; azonban ez nem jó termeléssel adja a kívánt terméket. A GnRH peptid analóg ciklizálási reakciólépése természetesen függ attól, hogy milyen típusú kötést akarunk létrehozni a 4- és 10-helyzetű egység között. Amennyiben a 4- és 10-helyzetben egyaránt Cys-csoportok találhatók, a ciklizálási lépést alkalmasan a peptid gyantáról való lehasítása és valamennyi védőcsoport eltávolítása után hajthatjuk végre. A ciklizált peptid formát vas(III) -cianid-oldattal, levegővel végrehajtott, vagy más, ismert oxidálási eljárással alakíthatjuk ki. Amennyiben a ciklizálás amidkötésen keresztül történik, amely a 4-helyzetben található amino-oldallánc és a 10-helyzetben található karboxil-oldallánc (amely előnyös lehet) között, vagy fordítva jön létre, előnyösen védett peptidet állítunk elő MBHA vagy BHA gyantán; és a karboxil-oldallánc benzil-észterét hidraziddá alakítjuk, miközben a 5 peptid a gyantához kötve marad. Ezt úgy hajthatjuk végre, hogy az amidkötésben résztvevő karboxil-oldalláncba OBzl-védőcsoportot vezetünk be, és a 6-helyzetben található csoport bármely aminocsoportján Fmoc-védőcsoportot alakítunk ki. Ezt a szelektív hidrazid aktiválást követően a 6-heIyzetű csoport bármely aminocsoportján található Fmoc kivételével a többi oldallánc védőcsoportokat eltávolítjuk, és a peptideket a gyantáról lehasítjuk. Ezután hajtjuk végre a ciklizálási reakciót izoamil-nitrit és erős sav, például sósav segítségével, amely reagenssel azidcsoportot alakítunk ki, ami a reakcióelegy semlegesítését követően a szabad aminocsoporttal reagál, és amid-kötést hoz létre. A ciklizálás után az Fmoc-csoportok bázikus reagenssel, például piperidinnel történő eltávolítása révén a peptid valamenynyi védőcsoportját eltávolítjuk. A peptidek ciklizálását a 4,115,544 számú (1987. szept. 19.), a 4,133,805 számú (1979. jan. 9.), a 4,140,767 számú (1979. febr. 20.), a 4,161,521 számú (1980. dec. 9.), a 4,244,947 számú (1981. jan. 13.) és a 4,261,885 számú (1981. ápr. 14.) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban általánosan leírták. A találmány szerint az (I) általános képletü vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy egy (II) általános képletű vegyületről, ahol az általános képletben X2—X9 jelentése az előzőekben megadott, az X2—X® csoportokat lehasítjuk, és/vagy az X9 csoportban szereplő gyantáról lehasítjuk a peptidet, és szükséges esetben az R4 és R10 egység között, még nem jelenlévő kovalens kötést kialakítjuk. A peptidet CMC oszlopon, ioncserélő kromatográfia, majd ezt követően Sephadex G-25 oszlopon, butanol-0,1 n ecetsav (1:1 térf. arány) eluens alkalmazásával végzett, vagy HPLC, megoszlásos, kromatográfia segítségével, az irodalomban ismert módszereknek megfelelően tisztítjuk. A találmány szerinti eljárással előállított peptidek kisebb mint 100 pg/kg testsúly dózisban hatásosak, amennyiben az ivarzás napján adagoljuk őket, és megakadályozzák a nőstény patkányok peteérését. A peteérés hosszab idejű megakadályozása érdekében a dózisszint körülbelül 0,1—2,5 mg/kg testsúly kell legyen. Ezek az antagonisták ugyancsak alkalmasak hím emlősöknek szabályos mennyiségben adagolva az ondósejtképződés megakadályozására, és így fogamzásgátlóként való alkalmazásra. Mivel a találmány szerinti eljárással előállított anyagok szabályos adagokban adagolva csökkenteni fogják a tesztoszteron (és normális, szexuálisan aktív hímekben nem kívánt következményeket eredményeznek), a GnRH antagonista adagolásával párhuzamosan indokolt tesztoszteron helyettesítő dózisokat is adagolni. Az antagonisták a fentiektől eltérő esetekben is alkalmasak a gonadotrop hormon-termelés, és szexuális szteroid-termelés szabályozás céljára. 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
