199159. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadásgátló peptidek és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

199159

10

anhidridet alkalmazó kapcsolást hajtunk végre 2,0 mmól Na-Boc-aminosav (Peptides International) alkalmazásával kivéve a Boc-Gln esetét, amelyet DCC/HOBT módszer alkalmazásával kapcsolunk. Az alkalmazott oldallánc védések az alábbiak: Asp(Chx), Glu(Bzl), Tyr(2-BrZ). A szintézis befejezése után a Na-Boc védőcsoportot 50% diklór-metános trifluor-ecetsav alkalmazásával távolijuk el. A gyantát háromszor diklór-metánnal mossuk, háromszor 10%-os diklór-me- tános diizopropil-etil-amin oldattal mosva semlegesítjük, majd vákuumban szárítjuk. A peptidről a védőcsoportokat eltávolítjuk, valamint azt gyantáról lehasítjuk, a gyantát 2% anizol tartalmú hidrogén-fluoriddal 35 percig 0°C-on kezelve. A hidrogén-fluoridot vákuumban 0°C-on eltávolítjuk és a peptidet etil-éterrel kicsapjuk majd 30%-os ecetsavval a gyantáról extraháljuk. Ezután liofilizáljuk.

A peptidet 92 X 2,6 cm Sephadex G-15 oszlopon 5%-os vizes ecetsavval sótalanítjuk és így tisztítjuk, majd liofilizáljuk. Ezután nagynyomású folyadékkromatográfiás elválasztást végzünk C18 Vydac 218TP1010 (250X10 MM) oszlopon 24%-os acetonitril tartalmú 0,1%-os vizes trifluorsav eluens és 5 ml/perc áramlás alkalmazásával. A fő terméket gyűjtjük és liofilizáljuk. 101 mg kívánt terméket kapunk (58% termelés a kezdeti gyanta oldatra számítva). A homogenitást nagynyomású folyadékkromatográfiás és vékonyréteg-kromatográfiás segítségével határozzuk meg. A nagynyomású folyadék kromatográfiás analízist Vydac 218PT54 (250X4,6 mm) Cl8oszlopon,2 ml/perc áramlás, t0=l,9 perc, 15—40% acetonitril tartalmú 0,1%-os vizes trifluorecetsav lineáris gradiens eluens alkalmazásával (1% perc gradiens) végezzük, az elúciós idő 14,4 perc. VRK (Merck 7515 20X20 cm Silica gél 60 lapok (0,25 mm vastag)) butanol/ecetsav/víz/ /piridin (6:1, 2:4, 8:6) (VRK I) R/=0,42;

izopropanol/cc. ammónium-hidroxid/víz (3:1:1) (VRK II) R/=0,32 butanol/ecetsav/ /víz (4:5:5) (VRK III) R/=0,70.

FAB-MS: (M+H) 1468,4±1 nm (számított 1468,6).

Aminosav analízis (6n HC1 hidrolízis; 24 ó, 106°C-on).

Asx 1,03 (1); Glx 5,05 (5); Pro 1,03 (1);

Gly 1,00 (1); Ile 0,97 (1); Leu 1,01 (1);

Tyr 0,93 (1); Phe 0,98 (1); NH3 1,06 (1);

280=1254.85 súly% pepiid tartalom. Az extinkció mérésekor 5-10—4 mólos oldatokat alkalmaztunk.

Az 1. példa eljárása szerint az alábbi 2—68. példa szerinti peptideket állítjuk elő.

2. példa

Ac-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-GIu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

9

3. példa

H-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

4. példa

H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr--Leu-Gln-OH

5. példa

H-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

6. példa

H-Asp-Phe-Glu-Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

7. példa

H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Ala-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH '

8. példa

H-Asp-Phe-Glu-Glu-IIe-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Ala-OH

9. példa

H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Glu-Leu-Ala-OH

10. példa

Ac-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr--Leu-Gln-OH

11. példa

Ac-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Len-Gln-OH

12. példa

Suc-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

13. példa

H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-NH2

14. példa

.H-Gly-Asp-Tyr-Glu-GIu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr--Leu-Gln-OH

15. példa

H-Gly-Asp-Trp-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr--Leu-Gln-OH

16. példa

H-Gly-Asp-pClPhe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

17. példa

H-Gly-Asp-pN02Phe-Glu-Glu-IIe-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

18. példa

H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Sar-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

19. példa

H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-DAla-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

20. példa

H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Hyp-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

1 i

6