199158. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminoglükozid-szteroidok, és hatóanyagként e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
199158 a) Radiokémia! vizsgálat A (Na+-K+)-ATP-ázban feldúsult mikroszóma-frakciót kutyavese külső velőjéből állítjuk elő, Jorgensen [Biochem. Biophys. Acta 356, 36—52 (1974)] módszere szerint. A 0,5 pg proteint tartalmazó, részlegesen tisztított enzimet 110 pl, 3 mmól/1 MgCl2-ot, 3 mmól/I EGTA-t, 80 mmól/1 Hepes-puffert (pH 7,4) és 2 mmól/1 Y2-P32-ATP-t tartalmazó elegyben 37°C-on 15 percen keresztül inkubáljuk, növekvő koncentrációban összehasonlító vegyületként ouabain vagy aminoglükozid-szteroidok jelenlétében. A reakciót 10% - végkoncentrációban 0,1 mól/1 koncentrációjú hideg perklórsav hozzáadásával leállítjuk, és hozzáadunk 0,5 ml 20 vegyes%-os aktívszén-szuszpenziót. A szuszpenziót centrifugáljuk és a felülúszóban lévő 32P mennyiségét folyadékszcintillációs számlálóval mérjük [Mall F. és munkatársai: Biochem. Pharm. 32(1), 46—53 (1984)]. A különböző koncentrációban jelenlévő aminoglükozid-szteroidok és az ouabain hatását a teljes (Na+-K+)-ATP-áz%-os gátlásában fejezzük ki, és kiszámítjuk az ICsn értékeket. Az (I) általános képletű vegyületek a fenti vizsgálatban inaktívaknak bizonyultak. b) (3H)-ouabain kiszorítása emberi vörösvérsejtekből A vizsgálatot Erdmann E. és munkatársai [Arzneim. Forsch. 34(11), No. 10, 1310 (1984)] módszere szerint végezzük. Közelítőleg 1 — 1,8X109/ml mosott eritrocitát 130 mmól/1 NaCI-ot, 1 mmól/1 MgCl2-ot, 10 mmól/1 glükózt, 10 mmól/1 szacharózt, 10 mmól/1 Tris/HCl-puffert (pH 7,4), 2X X10“9 mól/1 3H-ouabaint és növekvő koncentrációban jelzetlen aminoglükozid-szteroidokat tartalmazó elegyben 37°C-on 5 órán keresztül inkubálunk. A kötött ouabain mennyiségét gyors szűréses módszerrel (Whatman GF/C üvegszűrő membránon) határozzuk meg, amellyel elválasztjuk a szabad ouabaint a membránhoz kötöttől. A szűrőn maradt radioaktivitást folyadékszcintillációs számlálóval határozzuk meg. A 10-3 mól/1 jelzetlen ouabain jelenlétében mért kötődést tekintjük nemspecifikus kötődésnek. A disszociációs állandót (Kd értéket) a jelzetlen aminoglükozid-szteroidok azon koncentrációjából számítjuk ki, amely 50%-kai gátolja a3H-ouabain kötődést egyensúlyi helyzetben, Erdman és munkatársai [Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 283, 335 (1973)] módszere szerint. Az (I) általános képletű vegyületek a fenti vizsgálatban hatásosak, Kd értékük 10-9 és 10-“ közötti. c) (Na+-K+)-ATP-áz által médiáit Na+-kiáramlás gátlása emberi vörösvértestekben A vizsgálatot Garay és munkatársai [Biochem. Pharmacol. 33, 2013—2020 (1984)] módszere szerint végezzük. 3 A vörösvértesteket 20—25% -os hematokrit-értékben 74 mmól/1 MgCl2-ot, 2 mmól/1 KCl-ot, 84 mmól/1 szacharózt, 10 mmól/1 MOPS/Tris-puffert (pH 7,4 37°C-on) és 10 mmól/1 glükózt tartalmazó elegyben szuszpend áljuk. A vörösvértest-szuszpenziót hidegen Mg2+ -szacharóz-K+ közeget és növekvő koncentrációban ouabaint, és állandó koncentrációban aminoglükozid-szteroidot tartalmazó csövekbe mérjük. A csöveket 37°C-on inkubáljuk, és különböző időpontokban (0., 10., 20., 30. percben) alikvotokat veszünk a szuszpenzióból és hidegen centrifugáljuk. A felülúszóban atomabszorpciós módszerrel mérjük a külső Na+-koncentrációt. Elvégezzük az ouabain-függő Na+-kiáramlás gátlásának kinetikai analízisét a különböző aminoglükozid-szteroid-koncentrációk függvényében, és minden egyes vegyület esetén kiszámítjuk az IC50-értéket. A fenti vizsgálat szerint az (I) általános képletű vegyületek 10~9 és 10-6 mól/1 közötti koncentráció-tartományban hatásosak. (I) általános képletű aminoglükozid-szteroidok vérnyomáscsökkentő hatásának vizsgálata in vivo A szisztolés vérnyomás indirekt meghatározását csoportonként négy spontán hipertenzív, 8—10 hetes patkányon (SHR, Kyoto, szállítja: Charles River, Olaszország) végezzük. Az állatokat 36°C-os környezetben tartjuk 10—15 percen keresztül, és feljegyezzük a pulzusnyomást, majd mérjük a szisztolés vérnyomást és a szívverést, közvetett farok-mandzsetta-módszerrel, W+W BP rekordert (Model 8005) alkalmazva. A vizsgálandó vegyületeket orálisan adagoljuk, 5%-os gumiarábikum-oldatban szuszpendálva, naponta egy alkalommal, négy egymást követő napon keresztül, és a méréseket a kezelés előtt, és a kezelés után 1, illetve 5 órával végezzük, a kezelés első és negyedik napján. A kontroll állatok csak hordozóanyagot kapnak (0,2 ml/ /100 g testtömeg). A vizsgálandó vegyület hatását a szisztolés vérnyomásra a kezelés előtti és utáni értékek különböégéből számítjuk ki. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek a fenti vizsgálatban 0,01— 100 mg/kg dózisban hatásosnak bizonyultak. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket gyógyászati készítmények formájában alkalmazhatjuk a humán- és állatgyógyászat területén. A találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítményekben hordozóanyagként olyan szerves vagy szervetlen anyagokat alkalmazhatunk, amelyek enterális (például orális), parenterális vagy helyi adagolásra alkalmasak, és nem reagálnak a találmány szerinti eljárással előállított vegyületekkel. Hordozóanyagként például vizet, növényi eredetű olajokat, benzil-alkoholokat, alkilén-glikolokat, polietilén-glikolokat, glice-4 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
