199157. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 17-szubsztituált androszta-1,4-dién-3-on-származékok és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
199157 katársai által leír? módszer (Chemistry and Industry 211, 1962) szerint valamely alkalmas dehidrogénezőszerrel, például diklór-diciano-benzokinonnal valamely oldószerben visszafolyási hőmérsékleten kezeljük. A (IV) általános képletű vegyületeket a (VII) általános képletű vegyületekből kiindulva állítjuk elő. Az 1-es pozícióban a kettőskötést a fenti módszerrel (H.J.Ringold és munkatársai, 1962. Chem. And Ind. 211) alakítjuk ki. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek az androgéneknek ösztrogénekké történő biológiai átalakulásának inhibitorai, vagyis szteroid aromatáz inhibitorok. A vegyületek aromatáz inhibiciós aktivitását például a Prodie (A.M.H. Brodie és munkatársai, Steroids, 38, 693, 1981) által leírt és kis mértékben módosított in vivo patkányvizsgálatok alkalmazásával mutattuk ki. Kifejlett nőstény patkányokat 4 napos időközökben 2x100 I.U-nyi, terhes kancákból kinyert szérum-gonadotropin (PMSG) beadásával kezeltünk a petefészek aromatáz aktivitásának fokozására. A második PMSG adag beadása után 3 nap múlva 6 állatból álló csoportoknak orálisan és/vagy szubkután beadtuk az új aromatáz inhibitorokat. 24 óra múlva az állatokat megöltük, és a petefészekből izolált mikroszómákba Thompson és Siiteri (J.Biol. Chem. 249, 5364, 1974) módszerével meghatároztuk az aromatáz aktivitást. Ez az eljárás az aromatizálás mértékét úgy határozza meg, hogy méri a 3H20-nak az [lß,2ß-3H]-androszten-dionból való felszabadulását. Az inkubálást 30 percen át végezzük oly módon, hogy 1 ml inkubációs oldat 0,1 mg mikroszomatikus proteint, 100 nM [3H]-androszten:diont és 100 pM NADPH-t tartalmazott. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek androgén tulajdonságait töb-5 bek között androgén receptorokhoz való kötődési affinitásuk révén mutattuk ki. A citoplazma-androgén receptorokhoz (patkány-prosztata) való kötődési affinitást 5 a szabványos, dextránbevonatú aktívszén adszorpciós eljárással határoztuk meg (Raynaud J.P. és munkatársai J. Steroid. Biochem. 6, 615—622, 1975). A prosztataszövelet olyan Sprague-Dawley patkányokból nyertük, me- 10 lyeknek mind a mellékveséjét, mind pedig a heréjét eltávolítottuk. A szövetet 1:10 térfogatarányban 10 nM 7,4 pH-jú, 1,5 nM EDTA -t és 1 nM ditiotreitolt tartalmazó Tris-sósavban, motorhajtású keverőberendezésben homo- 15 genizáltuk. A homogenizátumot 105000 g-vel, 2 órán át, 0°C-on centrifugáltuk. A citoszolból aliqut mennyiségeket (0,2 ml) vettünk ki, és duplikátumok alakjában különböző koncentrációkban hozzáadtuk a vizsgált ve- 20 gyületeket, valamint meghatározott mehnyiségű [3H] -5a-dihidrotesztoszteront (DHT, végső koncentrációja 1 nM a 0,4 ml-es inkubációs térfogatban). Ezután a szabad radioaktív anyagokat dextránbevonatú aktívszén 0,2 mí- 25 -nyi szuszpenzióján adszorbeáltuk, majd 1,5 g-vel 10 percen át végzett centrifugálás után a kötött radioaktivitást az anyalúgban Rialuminával végzett folyadék-szcintillációs méréssel határoztuk meg. 30 A vizsgált vegyületeknek azon koncentrációját, mely a specifikus 3H-DHT kötődést 50%-kal csökkentette, egy olyan diagramból határoztuk meg, melyen a kötött radio- 35 aktivitást a szóbanforgó vegyület koncentrációjának logaritmusa függvényében ábrázoltuk. Az alábbi táblázat a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek egyik repre- 40 zentánsával, a 6-metilén-androszta-l,4-dién-17ß-ol-3-onnal, valamint a 2 177 700 sz. nagy-britanniai szabadalmi leírásban ismetetett 6-metilén-androszta-l ,4-dién-3, 17-dionnal kapott eredményeket mutatja. 6 Vegyület Androgénrecoptor kötési affinitás IC50(nM)x 6-metilén-androszta- 1,4-dién- 17ß“Ol-3“on 6 10 £ 82 6-metilén-andrőszta- 1,íi-dién~3, 17-dion 8 + 2 3 mérés standard deviációjának középértéke 5
