198965. lajstromszámú szabadalom • Enzimatikus eljárás penicillin származékok előállítására
1 HU 198965 B 2 mikre, katalázt, például szarvasmarhamáj katalázt adhatjuk a reakciókeverékhez. A folyamatot 20 - 40 *C, előnyösen 25 — 30 *C hőmérsékleten hajtjuk végre. N-(3-karboxi-fenil-acetil)-L-ciszteinil-D-valin szubsztrát esetében a legoptimálisabb hőmérséklet 27 °C volt. A folyamatot pH* 6—9, előnyösen 7,5 —8,5 kémhatásnál végezzük. A kívánt pH értéket pufferrel, például ammónium-karbonáttal, triszpufferrel vagy 2-morfolino-propánszulfonsawal tartjuk fenn. A folyamat alatt alkalmas redukálószert adunk az inkubációs keverékhez. Minthogy a folyamat oxidativ, a redukálószer nyilvánvalóan arra szolgál, hogy megakadályozza vagy mérsékelje a cisztein szulfhidril-csoportjának diszulfiddá oxidálódását. A redukálószer egyúttal azt is megakadályozhatja, hogy a vas(lI)-ion vas(III)-ionná oxidálódjon. Az utóbbi ugyanis sokkal kevésbé hatékony az izopenicillin-N-szintetáz stimulálásában, mint a vas(II)-ion. A fenti követelmények között gyorsan lejátszódik a penicillinképződés, ha feleslegben alkalmazott tisztított enzimet és nagy tisztaságú szubsztrátot használunk. Laboratóriumi méretekben a reakció 10 perc és 2 óra közötti időt igényel. Nagyobb térfogatnál valamivel hosszabb időre van szükség. A folyamatot oldószer, például aceton vagy etanol hozzáadásával állítjuk le. A kicsapódó fehérjét például centrifugálássa! elválasztjuk, és a terméket ismert módon kinyerjük a felülúszóból. A terméket tartalmazó vizes fázist fagyasztva szárítjuk, és a terméket HPLC-vel nyerjük ki, fordított fázisú oktadecilszilán oszlopot használva. A penicillin terméket a protein elválasztását követően extrakcióval is kinyerhetjük az inkubációs keverékből. A találmány egyik előnyös kivitelezésénél N-(3-karboxi-fenil-acetil)-L-ciszteinil-D-valint inkubálunk feleslegben alkalmazott, tisztított izopenicillin-N-szintetáz enzimmel, 6-(3-karboxi-íenil-acetil-amino)-2,2-dimetil-3-penámkarbonsav előállítására. Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. Az IR spektrumok rövidítései: e= erős, k = * közepes, gy = gyenge intenzitású csúcs. 1. példa N-(3-karboxi-fenil-acetil)-L-ciszteinil-D-valin előállítása A) Az izoflálsav-monobenzil-észterének előállításához 11,2 g (0,1 mól) izoftálsavat szuszpcndálunk 200 ml metilalkohol és 10 ml víz elegyében, hozzáadjuk 11,2 g (0,2 mól) káiium-hidroxid 100 ml mctil-alkoholban készült oldatát, és a keveréket egy éjszakán át kevertetjük szobahőmérsékleten. Csökkentett nyomáson eltávolítjuk az oldószert, hozzáadunk 250 ml dimetil-formamidot és 13,5 ml (1,1 g) benzilbromidot. A keveréket 2 órán át keverjük 100 BC hőmérsékleten, hozzáöntjük 500 ml, 10 g nátrium- hidrogén-karbonátot tartalmazó vizes oldathoz, és etil-acctáttal extrahálunk. A vizes fázist tömény sósavval megsavanyítjuk, etil-acetáttal extraháljuk és a kicsapódó izoftálsavat szűréssel eltávolítjuk. Az etil-acetátos fázist sóoldattal mossuk, nátrium-szulfáttal szárítjuk és bepároljuk. A monobcnzil-észtert és az izoftálsavat tartalmazó maradékot szilikagélen kromatografáljuk 3,73 g (15%) monobenzil-észtert nyerve. ‘H-NMR (300 MHz) delta (CDCI3): 5,42 (2H, s), 7,30-7,50 (5H, m), 7,59 (1H, t, J *7,7 Hz), 8,32 (2H, t, J *4,5Hz), 8,81 (1H, s).-IR (CHCI3): 2700 - 3400 (COOH), 1720 (s), 1700 (s)m’1. B) A 2,2,2-triklór-etil-3-(benzil-oxi-karbonil)-fenil-acetát előállításához 2,6 g izoftálsav-monobenzilészterből, 8 ml száraz benzolból és 2,6 ml (3 ekvivalens) tionil-kloridból álló reakciókeveréket 1 órán át melegítjük 80 °C hőmérsékleten. Csökkentett nyomáson eltávolítjuk az oldószert, hozzáadunk 10 ml száraz benzolt és csökkentett nyomásson újból eltávolítjuk az oldószert, hogy megszabaduljunk az el nem reagált tionil-klorid nyomoktól. A savkloridot 20 ml száraz benzolban oldjuk, és az oldatot feleslegben lévő 0 °C hőmérsékletű éteres diazometánhoz öntjük. Az oldatot 0 °C hőmérsékleten keverjük 20 percen keresztül, majd szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül. Az oldatot 0 *C hőmérsékleten kevertetjük 20 percen keresztül, majd szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül. Az oldószert és a diazoroetán-felesleget csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A kapott diazoketonhoz hozzáadunk 12 ml 2,2,2-triklór-etanoIt és az 50- — 60 °C hőmérsékletű reakciókeverékhez hozzáadunk 0,3 g ezüst-oxidot. Nitrogéngáz fejlődik, 2 óra múlva újabb 0,3 g ezüst-oxidot adunk hozzá, és a keverést 30 percen keresztül folytatjuk. Újabb 0,2 ezüst-oxidot adunk a reakciókeverékhez, 30 perc múlva a diazoketont elbontjuk TLC-vel nyomon követve. A reakciókeveréket kloroformmal hígítjuk, aktív szénnel kezeljük, szűrjük és bepároljuk. A maradékot "flash" kromatográfiával tisztítjuk, eluensként benzol és petroléter 1:1 arányú elegyét használva. 3,6 g 2.2.2- triklór-etil-észtert kapunk (88%-os termelés). Az alkalmazott diazometánt N-(nitrozokarbamidból kapjuk. 'H-NMR (CDCI3, 300 MHz) delta: 3,83 (2H, s), 4,76 (2H, s), 5,37 (2H, ss), 7,30 - 7,60 (7H, m), 8,04 (2H, m). IR (CHCI3): 3020 (k), 2960 (gy), 1755 (e), 1740 (e), 1610 (gy), 1590 (gy), 1500 (gy). 1450 (k), 1375 (k), 1280 (e) cm1. Tömegspektrum, m/c: 91 (100), 225 [22, M-CI3CH20C(0)1, 293 (45, M-Ph(H20)), 297 (14), 400 (7,7, M + *CI3), 402 (6,9, M + 2), 404 (2,8, M +4).. . C) A 3-(benzil-oxi-karbonil)-fenil-ecetsav előállításához 3,6 g, a fentiek szerint előállított 2.2.2- triklór-etil-észter 36 ml tetrahidrofuránban készült oldatához jó kevertetés mellett, szobahőmérsékleten hozzáadunk 7,2 g cinkport, majd 7,2 ml 1 M vizes kálium-dihidrogén-foszfát oldatot. 15 perc elmúltával a vékonyrétegkromatográfia szerint nem történt meg a reakció. További 7,2 g cinket adunk a keverékhez. Néhány perc elmói-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
