198965. lajstromszámú szabadalom • Enzimatikus eljárás penicillin származékok előállítására
1 4 * ^ lávái a keverék hőmérséklete emelkedik. 30 perc múlva a cinket szűréssel eltávolítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson elpárologtatjuk. A bepárlási maradékot kloroformban oldjuk, hozzáadunk 20 ml 2 n sósavat, és a keveréket 1 órán keresztül kevertetjük. A kloroformos fázist elválasztjuk, a vizes fázist kloroformmal extraháljuk. A kloroformos fázisokat egyesítjük, sóoldattal mossuk, nátrium-szulfáttal szárítjuk és bepároljuk. A maradékot "flash" kromatográfíával tisztítjuk eluensként etil-acetátot használva. 869 mg 3-(benzil-oxi-karbonii)-fenil-ecetsavat kapunk 37%-os m termelés). Op.: 95-% *C (éterből). Elemanalízis a C16Hi404 képlet alapján:' számított: C: 71,10, H: 5,22%, talált: C: 71,22, H: 5,27%. ‘H-NMR (300 MHz) delta (CDC13): 3,72 (2H, s), 5,37 (2H, s), 7,30-7,55 (7H, m), 7,98- -8,09 (2H, m). Tómegspektrum, m/e: 91 (34), 163 {100, M-Ph(H20)j, 252 (6,7, M-H20), 270 (10, M + ). IR (CHClj): 2800 ~ 3400 (COOH), 1715 (C-O)cm'1. -D) Az S-(4-metoxi-benzil)-L-ciszteinil-D-valin-difenil-metil-észter acilezése: 10 ml száraz metilén-kloridban egy éjszakán keresztül, szobahőmérsékleten kevertetjük 427 mg (1,58 mmól) 3-(benzil-oxi-karbonil)-fenil-ecetsavat, 390 mg (1 ekvivalens) 2-etoxi-N-etoxi-karbonil-l,2-dihidrokinolint és 1 ekvivalens mennyiségű S-(4- -metoxi-benzil)-L-ciszteinil-D-valin benzhidrilészterét. Az oldószert elpároljuk és a maradékot 80 ml etil-acetátban oldjuk. Az oldatot vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, sóoldattal, 10%-os vizes citromsavoldattal, ismét sóoldattal mossuk, nátrium-szulfáttal szárítjuk. Az oldószert elpároljuk, a maradékot "flash" kromatográfíával tisztítjuk, eluensként 20% etil-acetátot tartalmazó petrolétert használva. 1,005 g N-[3- -(benzil-oxi-karbonil)-fenil-acetil]-S-(4-metoxi-benzi!)-L-ciszteinil-D-valin-difenil-metil-észtert kapunk. Op.: 136 — 137 ®C (dietil-éterből). Elemanalízis a képlet alapján: számított: C: 71,22, H: 6,11, N: 3,69%; talált: C: 71,12, H: 6,02, N: 3,59%. >H-NMR (300 MHz) delta (CDC13):0,73 és 0,85 (mindegyik 3H, d, J - 6,9Hz), 2,23 (1H, m), 2,69 (1H, dd, J — 14,0, 7,5Hz), 2,82 (1H, dd, J * 14,0, 5,4Hz), 3,56 (2H, s), 3,69 (2H, s), 3,76 (3H, s), 4,52 (1H, dd, J - 7,5, 5,4Hz), 4,63 (1H, dd, J - 8,5, 4,4Hz), 5,35 (2H, s), 6,35 (1H, d, J-7,5Hz), 670 (1H, d, J-8,5Hz), 6,83 és 7,16 (mindegyik 2H, d, J-8,0Hz), 6,91 (1H, s), 7,28 - 7,48 (17H, m), 7,96 (2H, m). IR (CHC13): 3400, 3010, 2960, 1720, 1670, 1610,1515,1500 cm1. Tömegspektrum: 758 (M + ). A három védőcsoporttal ellátott, N-acetált termékből 150 mg-ot (0,2 mmól) feloldunk 3 ml metilén-kloridban és hozzáadunk 0,36 ml anizolt. Az oldatot jeges fürdőben lehűtjük, hozzáadunk 2 ml 0,5 mólos alumínium-klorid nitrometános oldatot. A reakciókeveréket 2 órán át kevertetjük 0 °C hőmérsékleten, majd 3 órán keresztül szobahőmérsékleten. A reakciókeveréket etil-acetáttal hígítjuk, 1 n sósavval mossuk és 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát vizes oldattal extraháljuk. Az extraktumot etil-acetáttal mossuk, sósavval savanyítjuk és a védőcsoportok nélküli pepiidet etil-acetáttal extraháljuk. Az extraktumot sóoldattal mossuk, bepároljuk, 70 mg N-(3-karboxi-fenil-acetil)-L-ciszteinil-D-valint nyerve (93%-os termelés). Op.: 196-197 °C (acetonból; bomlik). Elemanalízis a Ci7H22N206S képlet alapján: számított: C: 53,39, H: 5,80, N: 7,32%, talált: C: 53,55, H: 5,82, N: 7,23%. >H-NMR (CD3OD, 300 MHz) delta : 0,89 és 0,94 (mindegyik 3H, d, J =6,9Hz), 2,15 (1H, m), 2,81 és 2,90 (mindegyik 1H, dd, J = 14,0,6,5Hz), 3,67 (2H, s), 4,31 (1H, d, J - 5,4Hz), 4,58 (1H, t, J-6,5Hz), 7,32 (1H, t, J-7,7Hz), 7,56 (1H, d, J - 7,7Hz), 7,90 (1H, d, J - 7,7Hz), 8,01 (1H, s). Tömegspektrum (FAB EX. glicerin/oxálsav) m/e: 383 (M + 1). IR (KBr): 3300, 2800, 3300 (széles) 2580 (gy), 2560 (gy), 1730,1700,1650,1605 cm'1. 2. példa Az N-(3-karboxi-fenil-acetil)-L-ciszteinil-D-valin enzimatikus ciklizálásához az alábbi reakciókeveréket állítjuk össze: 1,4 mg (3,66 . 10~3 mmól) N-(3-karboxi-fenil-acetil)-L-ciszteinil-D-valin, 100 pl 100 mmólos ditiotreit oldat 100 pl 5 mmólos vas(II)-szuifát oldat, 100 pl 50 mmólos L-aszkorbinsav oldat, 50 pl kataláz (1/10 hígításban), 1 ml 50 mmólos ammónium-hidrogén-karbonát oldat 3,5 ml 50 mmólos ammónium-hidrogén-karbonát oldatban elkészített izopenicillin-N-szintetáz oldat (elkészítve 1 ml izopenicillin-N-szintetáz oldatból, mely Trisz.HCl pufferben készült; aktivitás 2700 Ne milliliterenként; fajlagos aktivitás milliliterenként 109,8 CU). A reakciókeveréket elosztjuk két azonos térfogatú részre és nyitott kémcsövekbe öntjük. A nyitott csöveket percenként 250-es fordulatszámmal inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten. 30 peré elteltével mindegyik csőhöz hozzáadunk 50 pl 100 mmólos ditiotreit oldatot és 50 pl 5 mmólos vas(ll)-szulfát oldatot, majd az inkubálást 30 percen át tovább folytatjuk. Az inkubációs keveréket egyesítjük, hozzáadunk 10 ml acetont és centrifugáljuk. A felülúszót leöntjük, szárazra pároljuk, és a maradékot fagyasztva szárítjuk. A terméket Cjg fordított fázisú analitikai oszlopon tisztítjuk, 3% acetonitrilból és 90% 10 mmólos ammóniumhidrogén-karbonát oldatból álló eluenst használva. íH-NMR (300 MHz, D20), delta:!,30 (3H, s), 1,38 (3H, s), 3,55 és 3,63 (mindegyik 1H, d, J - 15,0Hz), 4,07 (1H, s), 5,25 és 5,35 (mindegyik 1H, d, J -3,8Hz), 7,35 (2H, m), 7,71 (2H, m). A terméket nátrium-trimetil-szilil-propionát-df-gyel (1,83 . 10*4 mmól) NMR vizsgálatnak vetjük alá a 0-laktám meghatározására. A 6/9-(3- -karboxi-fenil-acetil-amino)-penicillánsav termék kitermelése 68%-os. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
