198952. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emlős agyalapi mirígy eredetű növekedési hormon kibocsátást elősegítő faktor (PGRF) előállítására

1

HU 198952 B

2

Ennek az összehasonlító vizsgálatnak az eredményei azt mutatják, hogy ekvimoláris arányban alkalmazva a szintetikus PGRF (1 — 40) rendszerint a natív peptid teljes biológiai aktivitásával, amint ezt az I. táblázat bemutatja. A szintetikus peptid ED50 értéke mintegy 113 pikogramm, ez tehát sokkal hatásosabb, mint bármely más olyan molekula, amelyet eddig GH felszabadító faktornak hirdettek.

I. táblázat

GRF Referencia GH kiválasztás Standard in vitro a kontroll százalékában 0,63 egység 173l 0,4

1,25 egység 230l 5,0

2,50 egység 347i 13,0

5,00 egység 4741 3,0

10,00 egység 674i 6,0

Natív PGRF (1-40)

12,5 femtomól 234il7 25 femtomól 3511 7 50 femtomól 528±16 5 100 femtomól 720132

200 femtomól 748± 7 Szintetikus PGRF (1-40)

10 femtomól 269l20 100 femtomól 7011 6 10 1000 femtomól 990i42

A növekedési hormon kiválasztásának in vitro vizsgálatain kívül in vivo kísérleteket is folytatunk, a szintetikus peptidet kb. 200 g testsúlyú, 15 pentobarbilállal érzéstelenített normál hím patkányokba injektálva. A II. táblázatban közölt eredmények azt mutatják, hogy a szintetikus PGRF peptid hatásosan segíti elő a növekedési hormon kiválasztását az agyalapi mirigyből.

20

II. táblázat

Szitetikus PGRF (1 — 40) in vivo hatása az agyalapi mirigy növekedési hormon kibocsátására, egyetlen intravénás injekció után normál patkányokban (4 állat kezelési dózisonként)

Dózisok Válaszok a szérum ir-GH nanogramm/ml-jeiben mérve a

(mikrogramm) jelzett időpontokban injekció előtt és után (perc)-1

+ 5

10

15

30

60

0

173±47

2511:81

339i139

3961121

7491440

316176

0,01

173l23

284120

238151

20U4726U47

261150

299125

0,1

276i 126

6941246

5821290

7581562

2801280170

2421129

1,0

142l24

455111825

17481564

7301158

234153

2671129

10,0

2341 76

707711943

46761585

24641378

6161112

223126

6/a. példa

A PGRF (1 — 37) amid — amelynek képlete H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg- 40-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-NH2, és amely nem tartozik az igényelt oltalmi körbe — szintézisét lépésenkénti módszerrel hajtjuk végre, Beckman 990 Peptide Synthesisert használva 45

MBHA gyantán, az 1. példában leírt módszer szerint. A peptidet alapvetően tisztának találjuk TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva.

Aminosav-analízist is végzünk hidrolízis után annak ellenőrzésére, vajon korrekt szekvenciát 50

nyertünk-e. Az analízis a következő eredményt adja: Asx(4,02), Thr(0,80), Ser(3,49), Glx(6,90), Gly(l,92), Ala(3,08), Val(l,05), Met(l,01), He

(1,77), Leu(4,05), Tyr(2,02), Phe(l,14), Lys (2,50) és Arg(3,27). Az analízis igazolja a kor- 55 rekt szekvenciát.

A további vizsgálatok azt mutatják, hogy a 4. példa szerinti szintetikus PGRF analóg lényegileg ugyanazt a biológiai potenciált mutatja, mint a natív PGRF (1 — 40) és hogy a 6. és 6/a. példa szerinti szintetikus fragmensek is nagyon jelentős biológiai potenciállal bírnak. Továbbá az 5. példa szerinti (PGRF(1 —40) peptid, amely akarboxamid csoportot vise a C-terminálison, lényegileg kétszeres biológiai potenciállal rendelkezik, mint a 7. példában a vizsgált szintetikus peptid.

8. példa

A 7. példában leírt in vitro vizsgálatokat megismételjük natív PGRF (1 — 40)-et és natív PGRF (1 —44)-et használva; az eredmények azt mutatják, hogy a natív PGRF(1 — 44) több, mint kétszeres biológiai potenciállal rendelkezik.

8