198952. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emlős agyalapi mirígy eredetű növekedési hormon kibocsátást elősegítő faktor (PGRF) előállítására
1 HU 198952 B 2 A találmány tárgya olyan új pepiid előállítási eljárása, amely befolyást gyakorol az agyalapi mirigy funkciójára emberben és más emlősökben. A pepiid elősegíti az agyalapi mirigyből a növekedési hormon kibocsátását. Az 1950-es évek eleje óta a fiziológusok és klinikai szakemberek felismerték, hogy az agy hipotalamusa szabályozza az agyalapi mirigy öszszes kiválasztási funkcióját. Ez a szabályozás neurohumorális, a hipotalamusban fajlagos neuroszekréciós neuronokkal, amelyek fajlagos polipeptideket termelnek, ezek szerepe az, hogy beindítsák alkalomszerűen vagy állandó jelleggel az egyes agyalapi mirigy hormonok kiválasztását. Ezideig a következő, hipotalamus által kiválasztott, kibocsátást elősegítő faktorokat azonosították: tirotropin és prolaktin (TRF tripeptid) agyalapi mirigy hormonok, luteinizáló hormon és a tüsző-stimuláló hormon, agyalapi mirigy gonadotropinok (LRF, LH — RH, GnRH vagy Gn-RF dekapeptidek), béta-endorfin és adrenokortikotropin agyalapi mirigy hormonok (41 aminosavat tartalmazó CRF polipeplid) kibocsátását elősegítő faktorok. Ezeken felül egy gátló faktort is jellemezlek: a hipotalamus-eredetű szomatostatin gátolja az agyalapi mirigyben a növekedési hormon kibocsátását. Minden egyes hipotalamus eredetű kibocsátó faktort, valamint a szomatostalint totálszintézissel reprodukálták, és a natív szerkezet több analógját is szintetizálták, amelyek közül néhánynak nagyobb az aktivitása, mint a természetes vegyületnek. Ez ideig az agyalapi mirigyből a növekedési hormon kiválasztását elősegítő hipotalamus-eredetű, kibocsátást elősegítő faktor, vagy más néven szomatotropin és nincs azonosítva, bár jelentős fiziológiai és klinikai bizonyítékok vannak létezésére. A fő problémák egyike a hipotalamus eredetű, növekedési hormon kibocsátását elősegítő faktor (a továbbiakban GRF) jellemzésében és izolálásában az, hogy az aktív peptid a hipotalamus minden fragmensében végtelen kis menynyiségben látszik jelen lenni, úgy tűnik, hogy mindössze 5 és 150 femtomól közti mennyiségben. Ez sokkal kevesebb, mint amelyet a többi hipotalamus eredetű kibocsátást elősegítő faktor bármelyikéhez eddig kalkuláltak. Ebből az állításból egyenesen következik, hogy a hipotalamus eredetű GRF különlegesen nagy potenciálú. A hipotalamus eredetű GRF izolálásának egy másik fő problémája a szomatostatin igen nagy mennyiségének jelenléte a hipotalamus kivonatában, amely természetesen gátolja a kísérleti biológiai méréseket vagy hibás eredményeket ad ezekben. Az elmúlt néhány évben több laboratórium is úgy nyilatkozott, hogy izolálták és azonosították a hipotalamus eredetű GRF-et; mindezek a nyilatkozatok azonban meseterséges termékekre vonatkoztak, amint ezt később a szerzők elismerték (Schally, A. V. S. és munkatársai: J. Bioi Chem. 246, 6647, 1971; Veber, D. F. és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Commun, 45, 235, 1971). Az ilyen inkorrekt nyilatkozatokat részben meg lehet magyarázni a biológiai mérések nehézségeivel a növekedési hormon kibocsátásának becslésében. Mi egy 44 aminosav-maradékból álló polipeptidet izoláltunk humán hasnyálmirigy Langerhans-sziget sejt tumorból, tisztítottuk, jellemeztük, szintetizáltuk és megvizsgáltuk. Ez a polipeptid elősegíti az agyalapi mirigyből a növekedési hormon (GH) kibocsátását. Ennek a pepiidnek a szekvenciája a következő: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg- Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-AIa-Arg-Leu-NH2-Ezt tekintjük humán hasnyálmirigy-eredetű GRF-nek, és a továbbiakban PGRF-nek nevezzük, de szomatokrininnek is nevezhetjük. Két másik, jól tisztított pepiidet is izoláltunk ezzel együtt, amelyek szintén mutatnak GH kibocsátást elősegítő aktivitást; ezek PGRF (1-37) szabad savnak és PGRF (1 — 40) szabad savnak bizonyultak. Ezeket a peptideket lehet alkalmazni a melegvérű és hidegvérű állatok növekedésének elősegítésére az állattenyésztésben. A találmány tárgyát nem képezik eljárások gyógyászati készítmények előállítására, amelyek PGRF-et, vagy annak analógját vagy biológiailag aktív fragmensét tartalmazzák, vagy a fentiek bármilyen nem toxikus sóját, gyógyszerészetileg elfogadható folyadékban vagy szilárd hordozóban diszpergálva. Az ilyen gyógyászati kompozíciókat mind a humán, mind az állatgyógyászatban lehet alkalmazni klinikai gyógyításban alkalmi vagy rendszeres adagolásban, diagnosztikai vagy terápiás célokra. A következőkben a találmány szerinti eljárást részletesebben leírjuk. A peptidek meghatározásánál Schröder és Lubke nomenklatúráját alkalmaztuk ["The Peptides", Academic Press (1965)], ahol a hagyományos megjelenítéssel összhangban az amino-csoport az N-terminálisnál a baloldalon van feltűntetve és a karboxilcsoport a C-terminálisnál a jobb oldalon. Ahol az aminosav gyöknek izomer formái vannak, a képletben mindig az aminosav L-formája értendő, hacsak határozottan másképpen nem jelöljük. A találmány tárgya tehát eljárás: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gly-Gln-R34-Asn-Gln-Glu-R38-Gly-R4Q-Arg-Ala-Arg-Leu (I) általános képletű peptidek ahol R34 jelentése Ser vagy Alá, R 38 jelentése Arg vagy Ser, R40 jelentése Alá vagy Arg, valamint a fenti peptidek 1 — 28. aminosavszekvenciájától az 1 — 43. aminosav-szekvenciáig terjedő fragmenseinek és e vegyületek C-terminális amidjainak előállítására. A peptideket a peptidkémiában szokásos módszerekkel lehet szintetizálni, így pl. kizárólagosan szilárd fázisú technikákkal, részlegesen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
