198952. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emlős agyalapi mirígy eredetű növekedési hormon kibocsátást elősegítő faktor (PGRF) előállítására
1 HU 198952 B 2 szilárd fázisú technikákkal, fragmens-kondenzációval, klasszikus, oldatban történő kapcsolásokkal. így pl. kizárólagosan szilárd fázisú technikák kivitelezhetők a "Solid-Phase Peptide Synthesis" (szilárd fázisú pepiid szintézis) című szakkönyv alapján (Stewart és Young szerkesztése, Freeman és Co. kiadás, San Francisco, 1969), és ilyen eljárást ismertet a 4.105.603. sz. amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás leíró része is (Vale és munkatársai, 1978. aug.8.). A szintézis fragmens-kondenzációs módszere a 3.972.859. sz. amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásban van részletesen ismertetve (1976. aug. 3.). Egyéb szintéziseket ismertet például a 3.842.067. (1974.okt.15.) és 3.862.925. (1975. jan. 28.) számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás. Rekombináns DNS technikákat használó szintetikus peptid-termelések is valószínűleg kielégítik majd a nagy menynyiségű kereskedelmi igényeket (ez azonban nem képezi a találmány tárgyát). A kapcsolásos típusú szintézisekben közös vonás a különböző aminosav-részek labilis oldallánc-csoportjainak védelme megfelelő védőcsoportokkal, amelyek megakadályozzák az adott helyen kémiai reakció megtörténtét, amíg a védőcsoportot végleg el nem távolítják. Általában szintén közös vonás egy alfa-amino csoport védelme egy aminosavon vagy egy fragmensen, amíg a többi rész a karboxil-csoportnál reagí' majd az alfa-amino csoportot védő csoport szelektív eltávolítása, hogy utat engedjenek a további reakciónak, amelynek ezen a helyen kell végbemennie. Következésképpen közös vonás, hogy a szintézis egy lépésében egy köztes vegyület képződik, amely a megfelelő csoportokhoz kötődő, oldalláncot védő csoportokkal együtt tartalmazza az egyes aminosav-gyököket a kívánt szekvenciának megfelelő helyzetben a peptid láncban. A jelen találmány szerinti eljárásban először a következő terméket állítjuk elő, a peptidkémiában szokásos eljárással: X1-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-lle-Phe-Thr == = (X4)-Asn-Ser(X5)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys (X7)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X3)-Ala-Arg (X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gln-Asp(X5)-R34(X?)-Asn-Gln-Glu(X3)-R«(X5 vagy X6)-Gly-R40 (X6)-Arg(X6)-Leu-X j ahol X* jelentése hidrogénatom, vagy a-amino-csoportot védő csoport. Az X^el jelzett a-amino-csoportot védő csoportok jól ismertek a polipeptidek lépésenkénti szintézisének gyakorlatából. Az X!-el jelzett, a-amino-csoportot védő csoportok a következő osztályokba sorolhatók: (1) acil-lípusú védőcsoportok, mint pl. formil-, trifluor-acetil-, ftalil-, toluolszulfonil- (Tos), benzolszulfonil-, nitrofenil-szulfenil-, tritil-szulfenil-, o-nitro-fenoxi-acetil-, klór-acetil- és 7- -klór-butiril-csoport; (2) aromás uretán-típusú védőcsoporlok, mint pl. benzil-oxi-karbonil-(Z) és helyettesített (Z), úgy mint p-klór-benzil-oxi-karbonil-, p-bróm-benzil-oxi-karbonil-, p-metoxi-benzil-oxi-karbonil-csoport; (3) alifás uretán-típusú védőcsoportok, mint pl. t-butil-oxi-karbonil-(BOC), diizopropil-metil-oxi-karbonil-, izopropil-oxi-karbonil-, etoxi-karbonil-, allil-oxi-karbonil-; (4) cikloalkil-uretán típusú védőcsoportok, mint pl. ciklopentil-oxi-karbonil-, adamantil-oxi-karbonil- és ciklohexil-oxi-karbonil-csoport; (5) tiouretán-típusú védőcsoportok, mint pl. fenil-tiokarbonil-csoport; (6) alkiltípusú védőcsoportok, mint pl. trifenil-metil(tritil)-, benzilcsoport; (7) trialkil-szilán csoportok, mint pl. trimetil-sziláncsoport. A legelőnyösebb a-amino-csoportot védő csoport a BOC. X2 jelentése a Tyr fenolos hidroxilcsoportját védő csoport, amely tetrahidropiranil-, tercier-butil-, tritil-, benzil-, CBZ, 4Br-CBZ és 2,6-diklór-benzil-csoportok valamelyike lehet. A legelőnyösebb védőcsoport a 2,6-diklór-benzil-csoport. X2 lehet hidrogénatom is, amely azt jelenti, hogy nincs védőcsoport a hidroxilcsoporton. X3 jelentése hidrogén vagy egy észtert képző védőcsoport az Asp vagy Glu karboxil-csoportján, amelyet benzil-, 2,6-diklór-benzil-, metil- és etil-csoportok közül lehet kiválasztani. X4 és X5 a Thr és Ser hidroxilcsoportjainak védőcsoportjai, amelyeket az acetil-, benzoil-, terc-butil-, tritil-, tetrahidropiranil-, benzil-, 2,6- -diklór-benzil- és CBZ csoportok közül lehet kiválasztani. A legelőnyösebb védőcsoport a benzil. X4 és/vagy X5 lehet hidrogénatom is, amely azt jelenti, hogy nincs védőcsoport a hidroxilcsoporton. X6 jelentése vagy védőcsoport az Arg guanidinocsoportjához, amelyet a nitro-, Tos, CBZ, adamanlil-oxi-karbonil- és BOC csoportok közül lehet kiválasztani; vagy hidrogénatom. X7 jelentése hidrogénatom vagy védőcsoport a Lys oldalláncának amino-szubsztituenséhez. Ilyen védőcsoportok lehetnek többek között — csak illusztráció céljából felsorolva — a 2-klór-benzil-oxi-karbonil-(2-Cl-Z), Tos, CBZ, t-pentil-oxi-karbonil- és BOC csoport. Az oldallánc amino-csoportját védő csoport kiválasztása nem kritikus, kivéve azt a követelményt, hogy olyannak kell lennie, amely az a-amino-csoportokról történő védőcsoport eltávolításánál nem szakad le a szintézis során. Vagyis az a-amino-csoportot védő csoport és az oldallánc aminocsoportját védő csoport nem lehet azonos. X8 jelentése az -OH, -OCH3, észterek, amidok, hidrazidok, -0-CH2 tartalmú gyanták és - NH-tartalmú gyanták (OH-csoporttól és amid-csoporttól eltérő csoportokkal) közül egy csoport, amelyek védőcsoportnak tekinthetők. A köztes termék általános képletében az X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 és X8 legalább egyikének védőcsoportnak kell lennie. A peptidek szintézisénél felhasználandó, megfelelő oldalláncot védő csoport kiválasztásánál a következő szabályokat kell követni: (1) a védőcsoport legyen stabil az a-amino csoportot védő csoport eltávolításához kiválasztott reagensek és reakciókörülmények alkalmazása közben a szintézis minden lépésénél; (2) a védőcsoport őrizze meg védő tulajdonságait és ne hasadjon le a kapcsolás körülményei között, és (3) az oldal5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
