198917. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,1-benzotiazepin-2-2-dioxid-5-karbonsav-származékok és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítása
1 HU 198917 B 2 luol-szulfonsav, naftalin-szulfonsav, szulfanilsav, ciklohexil-szulfonsav vagy az aszkorbinsav. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek értékes gyógyászati tulajdonságokkal rendelkeznek emlősök számára. Ezek a vegyületek a neutrofil granulociták kemotaktikus inhibitoraiként használhatók, de hatásosak az 5-lipoxigenáz szelektív inhibitoraiként is, továbbá gátolják a porcalapanyag leépülését. A találmány szerinti eljárással előállítható vegyületek jól használhatók emlősöknél olyan betegségek kezelésére és gyógyítására, amelyeknél megnövekedelt neutrofil aktiválás, megemelkedett lipoxigenáz-hatás vagy előrehaladott porcanyagleépülés szerepet játszik. A neutrofil aktiválás például szerepet játszik a reumás arthritis létrejötténél, az 5-lipoxigenáz például különböző allergiás állapotok kialakulásánál és az asztma keletkezésénél, a porcleépülés pedig például a csontízületi gyulladásnál. Az említett tulajdonságokat in vitro és in vivo kísérletek során előnyösen bebizonyíthatjuk emlősöknél, különösen például egerekkel, tengerimalacokkal, kutyákkal, nyulakkal, továbbá ezek kioperált, elkülönített szervein, szövetpróbáin vagy enzimes készítményeiken, így sejteken és folyadékokon, amelyeket emberi vérből kiválasztotti”>k. A találmány szerinti eljárással előállítható vegyületeket in vitro oldatok formájában, például előnyösen vizes oldatokként, és in vivo enterális vagy parenterális, előnyösen orális úton, például szuszpenziók vagy vizes oldatok formájában adhatjuk be, illetve alkalmazhatjuk. Az adagmennyiség tartománya in vitro 10“* és 10'9 moláris nagyság között van. Az in vivo adagtartomány a beadás módjától függően körülbelül 0,01 — 50 mg/kg, előnyösen körülbelül 0,10 — 25 mg/kg tartományban van. A neutrofil granulociták kemotaktikus aktivitásának a gátlását in vitro a következő módon határozhatjuk meg: például mérjük in vitro az f—MLP (formil-metionil-leucil-fenilalanin) kötődésének a gátlását az emberi neutrofil granulocitákhoz. Emberi neutrofil granulocitákat Ferrante és Thong eljárásának módosított változata szerint (J.-Immunol. Methods 24, 389, 1978) izolálunk. A vörös vérsejtecskéket, amelyek a neutrofil készítményben visszamaradnak, 0,83%-os ammónium-klorid- és 0,1 mólos trisz-HCl-oldattal 7,5 pH-n elkülönítve elroncsoljuk. A neutrofil granulocitákat Hanks-pufferben 0 °C-on 60 perc leforgása alatt 15 nM 3H-f-MLP-vel és a vizsgálandó vegyülettel inkubáljuk. Alikvot inkubátumot szűrünk, és mérjük az összes kötött 3H-f-MLP mennyiségét. A felesleges nem-radioaktív f-MLP jelenlétében kapott nem-fajlagos kötést levonjuk és a kötés százalékos gátlását a vizsgálandó vegyüld esetében megállapítjuk. Azoknak az oldószereknek a végső koncentrációja, így például dimetil-acetamid vagy etanol koncentrációja, amelyeket alkalmazunk a vizsgálandó vegyület oldása végett, az inkubációs elegyben nem haladhatja meg az 1%,-ot. A neutrofil granulociták kemotaktikus aktiválásának a gátlását in vivo úgy határozzuk meg, hogy mérjük a neutrofil granulociták felhalmozódásának gátlását karrageninnel átitatott poliuretánhabban patkányoknál orális beadás után. A lipoxigenáz gátlását például úgy határozzuk meg, hogy mérjük a gátlási hányadot 5-HETE|(5S)-5-hidroxi-6,8,ll,14-eikozatetraén-karbonsav] és leukotrién-B4 (LTB4, 5,12-dihidroxi-6,8,-10,14-eikozatetraén-karbonsav) szintézisénél A —23187 által stimulált tengerimalac polimorfmagú leukocitákban, különösen radiometrikus vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatok szerint, amelyeket Walker és Dawson írt le a J. Pharm. Pharmacol. 3|, 778. oldalon, 119191, valamint Jakschik és Lee ismertetett a Nature 287, 51. oldalán /1980/ 5-HETE- és LTB4-szerű vegyületek képződésének a mérésére 14C-arachidonsavból. Laukotrinck és 5-HETE képződésének a gátlását továbbá úgy határozzuk meg, hogy mérjük például azok koncentrációját az egész vérben orális beadás után patkányokban. A gyulladásgátló hatást úgy határozzuk meg, hogy mérjük az ödéma és az egymagos sejtfolyás gátlását orális beadás után patkánymodellen, amelynek során először mellhártyagyulladást okozunk olymódon, hogy karragenint fecskendezünk be a mellüregbe például A. P. Almeida és társai által a J. Pharmacol. Exp. Therap. 214. 74. oldalán /1980/ leírt módon. A porcalapanyag leépülésének a gátlását a szarvasmarhaorrporc-ízüleli savóshártya ko-kultúramodell alapján a következő módon határozzuk meg: 8/arvasmarha-orrporcválaszfal proteoglikán-matrixot 35S felvétele útján megjelölünk gikozaminoglikánba. Porcdarabokat éjszakán át olyan szulfátmentes közegben inkubálunk, amely ^S-nálrium-szulfátot tartalmaz. ^S-jelzett porcdarabokat együtt tenyésztünk normál válaszfal-szöveltenyészettel többhasznú szövettenyészetlapokon. Négynapos inkubálás után 100 mikrolitert kiveszünk. Porcdarabokat hidrolizálunk és 100 mikroliter porchidrolizátumot szitán kiveszünk. A 35S részarányt, amely felszabaduláskor a közegbe jut, meghatározzuk és kiszámítjuk a porcalapanyag leépülésének a százalékos gátlását. A porcalapanyag-leépülés gátlását úgy is meghatározhatjuk, hogy mérjük a proteoglikán felszabadulásának a csökkenését a szarvasmarhaorrporc sávos nyálkahártyás katabolin által okozott leépülésnél. A találmány szerinti eljárással előállított 2.b. példa szerinti vegyület nátriumsóként körülbelül lxl0‘6 mól koncentrációban hatásos f—MLP emberi neutrofil granulocitákhoz történő kötődésének a gátlásánál. A vegyület hatásosan csökkenti továbbá neutrofil granulocitáknak a felhalmozódását karragénnel átitatott habban patkányoknál 25 mg/kg p.o. beadás esetén, hatásosan akadályozza továbbá a leukotrién és 5-HETE képződését az egész patkányvérben 50 mg/kg p.o. beadásnál, jelentősen gátolja az ödémakialakulási és az egymagos sejtfolyást mellhártyagyulladás-modellen 10 mg/kg p.o. adagolás esetén 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
