198902. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gamma-allenil-gamma-amino-vajsav-származékok és ezetek tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
19 HU 198902 B 20 jelen ét állni hagyjuk, majd bepároljuk. A maradékot vízzel hígítjuk és diklór-metánnal ismételten extrahéljuk. Az egyesített diklór-meténos kivonatot vízmentes magnézium-szulfáttal szárítjuk és bepároljuk; a maradékként kapott olajszerű termék cisz- és transz-4-N-terc-‘butoxikarbonil-2,5,6-heptatriénsav-etilészter elegyéből éli. Ezt a terméket szilikagélen történő kromatografálással részlegesen tisztítjuk. Az allénszérmazékot tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd tetrahidrofurén és 20%-os sósavoldat 1 : 1 arányú elegyével 2 napig forraljuk visszafolyató hűtő alkalmazáséval. A reakcióelegyhez azután vizet adunk és éterrel extrahéljuk. Az így kapott terméket Ag 50 W x 8 gyantával ioncserélő kromatogréfiának vetjük alá; 20% piridint tartalmazó vízzel eluálunk, majd az eluátum bepárlésa útján kapott terméket nagynyomású folyadék-kromatográfiával (RP-18) tisztítjuk. Ily módon termékként transz-4-amino-2,5,6-heptatriénsavat kapunk. ’H NMR (D2O) 6: 4,5 (m, 1H, > HCNC), 5,1-5,3 (m, 2H, HzC=C=CCj> 5,35 - 5,65 (m, 1H, -CH=OC<), 6,1 (dd, 1H, J=0,65, 15,8 Hz, -HC=C0. 6,5 (dd, 1H, J=6,3, 15,8 Hz,-HC=C<); tömegspektrum (m/e 100): MH* 140, (MH-H2O 122), (MH ± NH2 124), 100. 19. példa Vizsgálati módszerek Sertés-agyvelőből származó emlősállati U-amino- vajsav- transzaminázt (GABA-T) Churchich és Moses [J. Bioi. Chem., 256, 1101 (1981)] módszere szerint tisztítunk. Bakteriális borostyénkősav-szemialdehid-dehidrogenázt (SSDH) állítunk elő bakteriális GABA-T nátrium-bór-hidrides inaktiválásával, a Sigma Chemical Co. cégtől beszerzett Pseudomonas fluorescens mikroorganizmusból kapott GABASE készítményben. Az emlősállati GABA-T készítményt inhibitorral (25 mikromól 1 millimólra) inkubálunk 8,6 pH-értékben, 25 °C hőmérsékleten, 1 mmól ß-merkapto-etanollal, különböző effektorok, mint 2-oxo-glutarát vagy piridoxál-P jelenlétében vagy ezek nélkül. Megfelelő időközökben alikvot-részeket vettünk ki az inkubációs elegyböl és meghatároztuk ezekben a megmaradt GABA-T aktivitást. A megmaradt aktivitás mérését oly módon végeztük, hogy a borostyénkősav-szemialdehid képződését az NADP SSDH-tól függő redukciójához kapcsoltuk és követtük az NADPH képződését 340 nm-nél egy spektrofotometriai küvettában, a Sigma Chemical Co. által az No. G-7507 bakteriális GABASE termékre megadott módszernek egy módosított alakja szerint. A küvetta a következő közeget tartalmazta: 100 mmól pirofoszfát puffer (pH = 8,6), 6 mmól í-amino-butirát, 5 mmól 2--oxo-glutarét, 3 mmól ß-merkapto-etanol, 1 mmól NADP és SSDH elegendő mennyiségben ahhoz, hogy a GABA-T aktivitás reakciósebesség-korlátozó legyen. 20, példa Caenorhabditis elegáns teszt A vizsgálandó vegyületeket minta-törzsoldatok készítése céljából dimetil-szulfoxidban oldottuk 10 mg/ml koncentrációban. A vizsgálat folyamán egy szövetkultúra-lemeznek mind a 24 mélyedésébe 1 ml M9 pufferoldatot helyeztünk (e pufferoldat összetétele: 6 g dinátriuin-hidrogén-foszfét, 3 g kélium-dihidrogén-foszfát, 5 g nátrium-klorid és 0,25 g magnézium-szulfét.HzO 1 liter vizes oldatban). 23 mélyedés mindegyikébe a megfelelő törzsoldat 10 jul mintáját adtuk. A 24. mélyedés vizsgálandó vegyületet nem tartalmazó kontrollként szerepelt. A vizsgálat kezdetekor mindegyik mélyedésbe egy-egy csepp C. elegáns szuszpenziót (25-50 kifejlett organizmus) cseppentettünk. 1 óra elteltével mindegyik mélyedésben meghatároztuk az aktív férgek számát és ezt a kezdeti értékhez viszonyítottuk. Az eredményeket az alábbi táblázatban foglaljuk össze: Vegyület % aktív féreg Kontroll 100% 4-amino-5,6-heptadiénsav-oktilészter-p-toluolszulfonsav-só 45% 4-amino-5-metil-5,6--heptánsav-oktilészter 25% 21. példa Nippostrongylus brásiliensis teszt A vizsgálandó vegyületet 50 pg/ml koncentrációban vizsgáltuk az N. brásiliensis harmadik lárva-állapota elleni hatása szempontjából. Edényenként körülbelül 50 La lárvát tartalmazó elegyet inkubáltattunk 7 napig 37 °C hőmérsékleten. A vizsgált vegyület aktivitásét az inokuléció utáni 1., 4. és 7. napon vizsgáltuk. Vegyület Életképes lárvák, X Kontroll 1. nap: 100% 4. nap: 100% 4-amino-5,6-hepta-diénsav-oktilészter-p-toluolszulfonsav-7. nap: 100%-só 1. nap: 64% 4. nap: 0% 7. nap: 0% 5 ' 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
