198796. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anioncserélő hordozólapok előállítására és szilárdfázisú eljárás és berendezés nukleinsavfragvensek szekvenciájának megállapítására
1 HU 198790 R 2 A találmány alkalmazási területe a nukleinsavfragmensek (a DNS és az RNS) szekvenciális analízise a molekuláris biológiában és a géntechnológiában, illetve az oligodezoxi- és oligoribonukleotidek szekvenciális analízise ezen fragmensek kémiai szintézise után. Szilárdfázisú eljárást először 1983. decemberében írtak le az S. A. Chuvpilo és V. V, Kravchenko: Bioorg. Khim. 9 (12) 1983., 1634-1637. p. irodalmi közleményben, de csak a hosszú DNS fragmensek sorrendjének megállapítására és kereskedelmileg kapható DEAE-papír (DE 81 jelű Whatman papir) használatával. Ez az eljárás a következő lépésekből áll: 1. ) az 5’- vagy 3'-helyzetben jelölt DNS-fragmens megkötése a hordozón, 2. ) mosás, 3. ) Maxain és Gilbert szerinti kémiai modifikációs reakciók reagens-fölösleg nélkül (azaz nem lombikban történő reakcióval) az A. M. Maxam és W. Gilbert: Methods in Enzymol. 65 (1980) 499-560. p. irodalmi közleményben leírtak alapján, 4. ) mosás, 5. ) szabványos körülmények közötti piperidin-reakció (a radioaktív fragmensek vesztesége csak 20%), 6. ) mosás 7. ) a fragmensek kétszeres kioldása a hordozóból 1 mól-os NaCl oldattal, 60 ~°C hőmérsékleten, 8. ) az anyag etanollal történő kicsapatása és kétszeres mosása 90%-os etanollal. A fentiekben leírt eljárás hátrányai:- A DE 81 papir nagyon kedvezőtlen mechanikai tulajdonságai különösen megnehezítik a hordozó vizes puffer-oldatban történő kezelését (főleg magasabb hőmérsékleten). A hordozó gyorsan szakad, málik, szétesik.- Az alkalmazott modifikációs reakciók A+G-, T+C- és C-reakciókhoz vezetnek és közel 100 százalékos veszteséget okoznak, ha reagens-fölösleggel lombikban (például Eppendorf-kupakban) hajtjuk végre azokat.- A DE 81 hordozó rossz mechanikai tulajdonságai következtében nagyszámú nukleinsavfragmens egyidejű szekventálása egy lombikban nem lehetséges. összesen 8 eljárási lépés szükséges. A 8. lépés (az etanollal történő kicsapatás) elvileg nem alkalmas automatikus üzemmód megvalósítására.- A 8 egységből álló oligonukleotidok ezen eljárással nem szekventálhatók, mivel az első 5’-helyzelű nukleotidok a kicsapatáskor elvesznek és így a minta sorrendje csak részben határozható meg. A felsorolt hátrányokból következően a leírt eljárás egyrészt nem automatizálható, másrészt a manuális kivitelezésnél sem lehet nagyobb számú nukleinsav fragmenset egyidejűleg szekvenlálni. A rövid fragmensek (a DNS- és RNS-oligomerek) sorrendje az eljárással nem határozható meg. A szilárdfázisú szekventálás kivitelezésére alkalmas berendezést eddig még nem írtak le. Az ismert szekventáló eljárásokat általában kereskedelemben kapható lombikokban, például Epperdorf-kupakokban és szokványos laboratóriumi üvegeszközökben hajtják végre. így több fragmens egyidejű szekventálása ugyan elvileg lehetséges, de az eljárás gazdaságtalan, és a megkötött nukleinsavfragmensek kicserélődésének veszélye nagy. A találmány célja olyan eljárás kifejlesztése, amellyel hosszabb és rövidebb nukleinsavíragmenseket egymás mellett nagy számban, gyorsan és a kicserélődés veszélye nélkül lehet meghatározni. Az eljárás megvalósításánál alapfeladat, hogy a nukleinsavfragmenseket úgy kössük meg egy szilárd hordozón, hogy a teljesen automatikus, vagy a biztonságos kézi kezelésük lehetséges legyen. A találmány szerint ezt az alapfeladatot, úgy oldjuk meg, hogy a nukleinsavfragmensek szilárdfázisú szekventáló eljárásánál újszerű, anioncserélö tulajdonságokkal rendelkező hordozó lapokat és az eljárás kivitelezésére szolgáló új berendezést alkalmazunk. A jelzett fragmensek megkötése a hordozó lapon önmagában ismert módon történik, például rácseppentéssel vagy gélekből történő elektroelúcióval (fragmensenként négy hordozó). A hordozót mossuk, ezután a megkötött fragmenset (vagy több fragmenset egyidejűleg) kémiailag modifikáljuk. A vegyi modifikációs reakcióknál dolgozhatunk reagens-fölösleggel vagy reagens-fölösleg nélkül. Ha reagens-fölösleg nélkül dolgozunk, akkor úgy járunk el, hogy a hordozólapot kémiailag inert alapra fektetjük, és annyi reagenst adunk mikropipetlával a hordozóra, hogy az éppen csak átnedvesedjék. Mosás után a szétválasztott fragmenseket egyenként piperidinnel reagáltatjuk, és szerves vegyületekkel, ionos anyagokkal vagy elektromágneses sugárzással eluáljuk. Az anioncserélő tulajdonsággal rendelkező, mechanikailag stabil hordozó lapokat a 245.785 számú német demokratikus köztársaságbeli szabadalmi leírásból ismert, adott alakú, vagy meghatározott alakkal nem rendelkező nagymolekulájú anyagok kémiai átalakításéval állítjuk elő. Az átalakításhoz alkalmazott vegyületek általános képlete ~ Rr 1Í2N- R— N^— R2 + Y^R3J (I)- a képletben R jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport, adott esetben egy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
