198796. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anioncserélő hordozólapok előállítására és szilárdfázisú eljárás és berendezés nukleinsavfragvensek szekvenciájának megállapítására
3 IIU 10879(5 B 4 nitrocsoporltal és/vagy 1-4 szénatomos alkanoil-metil-csoporttal szubsztituált benzilcsoport, R1, R2, és R3 jelentése 1-4 szénalomos alkilcsoporl vagy hidrogénatom, és Y jelentése halogénatora. Az ismert, kémiai átalakításra alkalmas nagyniolekulájú anyagok összetétele: 5-80 tórfogat% nagymolekulájú vegyület, 1-80 térfogat% 4,6-dihalogén-l,3,5-triazin-csoporttal szubsztituált nagymolekuléjú vegyület, 0,5 - 50 térfogat% 2,4,6-trihalogéri-l,3,5-Lriazin, maximum 20 Lérfogat% halogenid, adott esetben maximum 5 térfogat% pufferhatású vegyület, és adott esetben folyékony diszpergáló szer. Az adott alakú, vagy a meghatározott alakkal nem rendelkező, kémiailag aktiv töltőanyagot tartalmazó nagymolekulájú anyagok (I) általános képletű vegyületekkel történő közvetlen kémiai átalakítása helyett előnyösebb lehet a kémiai átalakítás folyamán az (I) általános képletű vegyületek előállítása a (II) általános képletű vegyületek [Y-R-NHj]4 Y- (II) és a (III) általános képletű tercier aminok R1 N R2 (III) R3 reakciójával. Az első esetben adott alakú, kémiailag aktiv töltőanyagot tartalmazó nagymolekulájú anyagokat, például mechanikailag stabil cellulóz-papírokat, -fátylakat, vagy -szöveteket alakítunk át kémiai úton és Így mechanikailag stabil, nagy (nukleinsavakra 120 /ug/cm2- -ig terjedő) megkötőképességű anioncserélő hordozó lapokat állítunk elő. A második esetben meghatározott alakkal nem rendelkező, kémiailag aktiv töltőanyagot tartalmazó nagymolekulájú anyagokat, például szemcsés, kristályos vagy szálas cellulózt modifikálunk és így anioncseréló anyagot kapunk, amelyet vagy ebben az alakjában alkalmazunk, vagy folyékony diszpergáló szerrel anioncserélő hordozó lappá dolgozunk fel. Az (I) általános képletű vegyületekkel, illetve a tercier-aminokkal reagáltatott (II) általános képletű vegyületekkel - amikor az általános képletekben R jelentése a fent megadott - átalakított, adott alakú vagy meghatározott alakkal nem rendelkező, kémiailag aktiv töltőanyagot tartalmazó nagymolekulájú anyagok olyan anioncseréló tulajdonságú anyagok, amelyek vegyileg primer, szekunder és tercier aminokkal eluálhatók. Ennek a kémiai elúciónak nagy a jelentősége a nukleinsavfragmensek találmány szerinti szilárdfázisú szekventáló eljárásában, illetve az agaróz- vagy poli(akril-ainid)-gélekből történő Dh'S-fragmens izoláló eljárásban. Az (I) általános képletű vegyületekkel amikor az általános képletben R jelentése szubsztituált o-nitro-benzilészter vagy szubsztituált metil-fenanil-észter -átalakított, adoLt alakú vagy meghatározott alakkal nem rendelkező, kémiailag aktív töltőanyagot tartalmazó nagy molekulájú anyagok olyan anioncserélő tulajdonságú anyagok, amelyek fotoliti kusan, azaz elektromágneses sugárzás alkalmazásával eluálhatók, amely előnyös az eljárás automatizáHiatósága szempontjából. Az eddig említett ioncserélő anyagok ezen felül még ionos anyagokkal, azaz nagy ionerősségű sókkal, például NlUUCCb; (NIUJzCOj; [(CzHübNllhCOs; (CzilsbNHOOC-CII3; NII4OOCCH3; KükPCh; NaCl is eluálhatók. A leirt anioncserélő anyagok előnye, hogy nagy a megkölöképességük és kiemelkedően jó - különösen a lap formájúaknak - a mechanikai stabilitásuk. így a meghatározott alakú ioncserélők további molekuláris biológiai és biokémiai kutatásoknál is különösen alkalmazást nyerhetnek. A szokásos anioncserélökkel ellentétben a találmány szerinti ioncserélők az ionos elúción kívül szerves vegyületekkel, például piperidinnel vagy egy primer, szekunder vagy tercier aminnal, vagy elektromágneses sugárzással is eluálhatók. A megkötéskor egy vagy több (1 vagy n) 5’- vagy 3’-helyzetben jelölt, hosszú vagy rövid nukleinsavfragmenset viszünk fel 4 vagy 4 x n darab különálló, mechanikailag stabil, körülbelül 1-2 mm x 1-2 mm nagyságú, anionoseréö tulajdonsággal rendelkező hordozó lapra. A hordozólap sémáját az 5. ábrán mutatjuk be. Egy másik megoldás szerint az n darab 5’- vagy 3'-helyzetben jelölt, hosszú vagy rövid nukleinsavfragmenset 4 darab geometriailag nagyobb méretű hordozó lapon kötjük meg úgy, hogy mindegyik hordozó lapra felvísszük az n darab fragmenset, köztük biztonsági térközt hagyva. A hordozólap sémája a 6. ábrán látható. Minden hordozó lapot azonosító jellel kell ellátni. A megkötés után a hordozó lapokat kétszer egymás után vízzel és etanollal mossuk a sók és más szennyeződések eltávolítása érdekében. A mosás után rövid ideig levegővel vagy adott esetben meleg levegővel szárítjuk. A fragmensek kémiai modifikálását a következőképpen végezzük: a) Egy fragmenst 4 db különálló hordozó lapon legalább 4 különböző modifikáló reakciónak (G, A+G, T+C, C) vetünk alá. Ennek érdekében minden egyes 1-2 mm 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
