198757. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nebramicin komponensek előállítására
1 HU 198757 B 2 A találmány tárgya eljárás nebramicin komponensek előállítására 6"-0-karbamoil-tobramicin és 6"-0-karbamoil-kanamicin B mennyiségének szelektív növelésével, oly módon, hogy a táptalajhoz 0,1-0,2% cink- és/vagy mangánsót, célszerűen 0,15-0,20 t% cinkszulfátot és/vagy mangánszulfótol adagolunk és 0,1-1,2 levegő tf/táptalaj tf/perc arányú levegőztetés és kevertetés mellett a hőmérsékletet 37 °C-41 °C között tartjuk. A Streptomyces lenebrarius törzsek bioszintézise során keletkező nebramicin néven ismert antibioLikum-komplex a fő komponensek, a 6"-0-karbamoil-lobramicin (nebranticin-5’) és 6"-0-karbamoil-kanamicin B (nebrainicin-4), valamint, apramicin (nebramicin-2) mellett nagy számú (8-10) kis mennyiségben jelenlévő rokonvegyületet ún. minor komponenseket is tartalmaz. Mind a fő komponensek, mind a minor komponensek főként a fermentáció második szakaszában képződnek. Humán gyógyászati szempontból a 6"-0- -karbamoil-tobramicin lúgos hidrolízisével nyert tobramicin a legfontosabb, amely mint széles spektrumú antibiotikum, elsősorban polirezisztens baktériumok okozta fertőzések leküzdésében játszik jelentős szerepet. Az utóbbi években a 6"-0-karbamoil-kanamicin B lúgos hidrolízisével nyert kanamicin B jelentősége is növekvőben van, mind a humán terápiában, mind az állatgyógyászat területén. A nebramicin-komplex antibiotikumainak fermentációs úton történő előállítását és az összetevők tiszta formában való elkülönitését először az Eli Lilly cég szakemberei oldották meg (3.691.279 számú USA-beli szabadalmi leírás). Ugyancsak a nebramicin-komplex fermentációs előállítását ismerteti a 176.103. számú magyar szabadalmi leírás, amely szerint a Streptomyces tenebrarius törzs [NCAIM B (P) 000169] egy új antibiotikum-rezisztens variánsát használják termelő törzsként. A nebramicin-komplex antibiotikumnak kinyerése és tiszta formában történő elkülönítése a 174.315 számú magyar szabadalmi leírás szerint valósítható meg. Tekintettel arra, hogy a nebramicin-komplex antibiotikumai közül a tobramicin a legértékesebb, az eljárás fejlesztése során a kutatók arra törekedtek, hogy elsősorban a tobramicin mennyiségét növeljék. E cél elérésére az egyik lehetőség, genetikai úton olyan mutánsok izolálása, amelyek CBak egy antibiotikumot, pl. csak 6"-0- -karbamoil-tobramicint termelnek. Ebben az esetben még az sem fontos, hogy a tobramicin abszolút mennyisége több legyen, mint amennyi a nebramicin-komplexben képződött, mivel a gyártás a technológiai lépések lényeges egyszerűsödése következtében (elmarad az egyes komponensek egymástól való elkülönítése) alacsonyabb tobramicin tartalomnál is gazdaságos. A genetikai kísérletek eredményeiről beszámoló közlemény (Dev. Ind. Mikrobiol 17, 61-77, 1976) szerint elfogadható szintű 6"-0- -karbamoil-tobramicin termelés mellett a maximális célt (tiszta 6"-0-karbamoil-tobramicin fermentációt.) nem sikerült elérni, mivel a rokon antibiotikumok közül elsősorban a 6"-0- -karbamoil-kanamicin B szintén képződik. A 190.680 és a 195.252 számú magyar szabadalmi leírások egy új, genetikai úton előállított Streptomyces tenebrarius törzset [NCAIM B (P) 0002041 és alkalmazását ismertetik, amely törzs jelentős mennyiségű 6"-0- -karbamoil-tobramicint termel, apramicint egyáltalán nem és 6"-0-karbamoil-kanamicint csak nyomokban. Az utóbbi szabadalmi leírás szerint az új törzs és mór ismert Streptomyces Lenebrarius törzsek tenyészeteinek megfelelő arányban történő kombinálásával az antibiotikum komponensek arányát elsősorban az apramicinhez viszonyítva lehet változtatni. A módszert nehézkessé teszi az a körülmény, hogy két inok uhun fermentációt szükséges készíteni és a törzsek eltérő' növekedési erélye következtében a fermentáció körülményeinek optimalizálását, az alkalmazott törzsek sajátságait figyelembe véve, minden esetben el kell végezni. A 6"-0-karbamoil-tobramicin mennyiségi növelésének másik lehetősége a fermentációs technológia módosítása. Ez magába foglalja a tenyésztési körülmények célszerű megváltoztatását, a táptalaj összetételének módosítását, a táptalaj komponensek mennyiségi optimalizálását,. Így például Stark és mtsai vizsgálták a glükóz, szójaliszt, kazeinhidrolizátum, növényi olajok, magnézium, foszfátok szerepét és elvégezték ezek mennyiségi optimalizálását (Antim. Ag. and Chemother. 314-323 1967). A fermentációs körülmények megváltoztatásának további lehetőségeit vizsgálva bizonyos növényi olajok kedvező hatásáról, valamint arról a tapasztalatról számoltak be, hogy nyomelemek, elsősorban a cink- és mangánsók, mint enzim-aktivátorok előnyös hatása fokozható a sókoncentráció maximum 0,05% értékig történő növelésével. (Develop. Indust. Mikrobiol. 2. 77-89-1979). A találmány célja olyan új tenyésztési eljárás kidolgozása, amely valamely Streptomyces tenebrarius törzs fermentációs körülményeinek alkalmas megválasztásával lehetővé teszi a 6"-0-karbamoil-tobramicin és 6"-0- -karbamoil-kanamicin B mennyiségének növelését és képződési arányának a kívánalmak szerinti módosítását. A találmány alapját az a felismerés képezi, hogy cink- és/vagy mangánsók 0,1- -0,2 t% mennyiségben történő adagoláskor, meglepő módon a fémsók enzim-gátló hatása az egyes antibiotikum komponensek bioszintézisében eltérő módon nyilvánul meg (szelektív toxicitás). További felismerésünk szerint ez a szelektív hatás a levegőztetés mértékének vál5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
