198741. lajstromszámú szabadalom • Eljárás citorodin S származékok, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
5 HU 198741 B 6 általános képletű maleimiddel reagáltatjuk, így olyan (I) általános képletű citorodin S származékot kapunk, ahol X jelentése (a) vagy (g) képletű csoport. Melléktermékként N-hidroxi-szukcinimid képződik. (III) általános képletű maleimidként például N-'x-maleimido-butiril-oxi-szukcinimid [GMBS, R2=-(CH2)3-], szukcinimidil-4-(N-maleimido-metil)-ciklohexán-karboxilát alkalmazható. A fenti reakciót előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy a citorodin S aminoszármazékát alkalmas oldószerben (például diklór-metánban, diklór-etánban, kloroformban, piridinben, trietil-aminban, stb.) szobahőmérsékleten vagy jeges hűtés közben maleimiddel kezeljük. Az igy kapott citorodin S származékot, amelybe egy maleim idoc sopor tot vezettünk be, addíciós reakcióban bármely, tiolcsoportot tartalmazó proteinnel vagy vegyülettel reagáltatjuk. A maleimidocsoportban jelenlevő kettőskötés vesz részt a tiolcsoporttal végbemenő elektrofil addíciós reakcióban, igy, ahogyan ezt később ismertetjük, a maleimidocsoport és az immunoglobulinban kialakított tiolcsoportok között végbemenő addíciós reakció lehetővé teszi a komplex képzését. A komplex képzésére immunoglobulinként előnyösen rákos sejtekben specifikusán képződő membrán protein elleni monoklonális vagy poliklonális antitestet alkalmazunk. Klinikai alkalmazáskor az is kívánatos, hogy olyan antitestet alkamazzunk, amelyből az Fc proteineket eltávolitottuk, ha nem-humán eredetű antitestet alkalmazunk. A hatékonyság szempontjából azonban a citorodin S mellett a teljes antitestet célszerű alkalmazni. Különösen előnyös immunoglobulinok a rák-specifikus proteinek, például karcinoembrionális antigén (CEA) vagy oC-fötoprotein (AFP) elleni monoklonális antitestek. Karcinoembrionális antigén elleni monoklonális antitestet szokásos módon állíthatunk elő, amikor is egereket kezelünk antigénnel, kivesszük az egér lépét, a lépsejteket HAT-érzékeny mieloma sejtekkel fuzionáljuk polietilén-glikolos módszerrel, és a hibridoma sejteket szelektáljuk HAT-tápközegen, mint szelektív tápközegen, és a hibridoma sejteket egerekbe transzplantáljuk. Mielőtt az immunoglobulint a komplex előállítása céljából maleimidocsoportokat tartalmazó citorodin S-sel reagáltatjuk, az immunoglobulinba tiolc sopor tokát vezetünk be. A tiolcsoport bevezetése céljából az immunoglobulint (VII) általános képletű N-szukcinimiddel reagáltatjuk, ahol R2 jelentése a fenti, és R5 jelentése tiol védőcsoport, például acilcsoport, mint például acetil- vagy 2-piridil-tio-csoport, így a fenti (IV) általános képletű tiolozott immunoglobulint kapjuk. (VII) általános képletű N-szukcinimidként előnyösen N-szukcinimidil-S-acetil-tioacetát [(VIII) képletű vegyület, SATA] alkalmazható. A SATA-t az immunoglobulin aminocsoportjával reagáltatjuk, így egy -NH-CO-CH2-S-CO-CH3 amidkötés alakul ki, amelyben a tiolcsoport acetilcsoporttal védett formában van jelen, és melléktermékként N-hidroxi-szukcinimid képződik. A tiolcsoportról a védőcsoportot például úgy távolitjuk el, hogy 7,5 pH-nál hidroxil-aminnal reagáltatjuk, igy az előbbi csoportot egy i’eaktív -NH-CO-CH2- -SH csoporttá alakítjuk. A tiolcsoport bizonyos körülmények között hajlamos oxidálódni, így immunoglobulin polimer képződik. Ezért kívánatos, hogy az acetilcsoport védőcsoportjának eltávolítását 25 °C-on, kb. 1 óra alatt hajtsuk végre, közvetlenül a maleimidocsoportot tartalmazó citorodin S származékkal végzett reakció előtt. A tiolcsoportot 1-20, előnyösen 5-20 arányban vezetjük be immunoglobulin molekulánként, a SATA mennyiségétől függően. A bevezetés nem eredményezi az immunoglobulin antitest-aktivitásának elvesztését. N-szukcinimidil-3-(2-piridil-ditio)-propionát alkalmazása tiolbevezető reagensként SATA helyett és ditiotretol alkalmazása védőcsoport eltávolító reagensként az -NH-CO-Cíh-CHi-SH csoportról az immunoglobulinban levő aminocsoporttal együtt Az igy előállított, tiolcsoportot tartalmazó (IV) képletű immunoglobulint a maleimidocsoportot tartalmazó citorodin S-sel reagáltatjuk, így a találmány szerinti immunoglobulin-komplexet kapjuk. A reakciót úgy hajtjuk végre, hogy a maleimidocsoportot tartalmazó citorodin S származék vízzel elegyedő szerves oldószerre] (pédául metanollal, etanollal, dimetil-formamiddal) készült oldatát 7,5 pH értéknél a tiolcsoportot tartalmazó immunoglobulin vizes oldatával keverjük. A tiolcsoportot tartalmazó citorodin S származék, ahol X jelentése -NH-R^SH, maleimidocsoportot tartalmazó proteinnel vagy más vegyülettel addíciós reakcióba lép. A maleimidocsoport kettőskötése a tiolcsoporttal elektrofil addíciós reakcióban reagál. Ahogyan ezt a későbbiekben ismertetjük, komplex képezhető úgy, hogy a tiolcsoportot és az immunoglobulinban jelenlevő maleimidocsoportot reagáltatjuk. A találmány szerinti eljárásban a komplex képzésére alkalmazható immunoglobulint a későbbiekben írjuk le. Mielőtt az immunoglobulint a tiolcsoportot tartalmazó citorodin S származékkal reagáltatjuk, az ímmunoglobulinba maleimidocsoportot vezetünk be. E célból egy (III) általános képletű maleimidszármazékot, ahol R2 jelentése a fenti, reagáltatunk immunoglobulinnal, így az (V) általános képletű, maleimi-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
