198734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rezofurin szk-ok glikozidjainak előállítására, eljárás glikozidázok és szacharid láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására és diagnosztikumok enzimek kimutatására
1 HU 198734 B 2 idő kb. 1,5 óra). Ezután a reakcióelegyet 25 “C hőmérsékletű fürdővel melegítve forgó bepárlóberendezésben térfogatának 1/3 részére bepároljuk, majd hűtés közben tömény sósavval színátváltás bekövetkeztéig megsavanyítjuk az elegyet, melynek hatására a kívánt termék kiválik. Ezt híg sósavval mossuk, majd vákuumban kalciumklorid felett szárítjuk és így rezorufm-l-karbonsav-metil-észtert kapunk. A kitermelés 30,9 g, ami az elméletire számított kitermelés 36%ának felel meg. 'H-NMR (DMSO-d6): 5= 3,98 (s, 3H); 6,47 (d, J = 2,2Hz, 1H); 6,85-6,95 (m, 2H); 7,09 (d, J = 2,2Hz, 1H); 7,60 (d, J = 9,6Hz, 1H). Fluoreszcencia: abszorbeió: Amax= 570 nm, emisszió: Amax = 588 nm. Analóg módon állítjuk elő a) 3,5-dihidroxi-benzoesavból és nitrozo-rezorcinból rezazurin-l-karbonsavon keresztül a rezorufin-l-karbonsavat, UV/V1S (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH = 7,5): Amax = 569 nm; b) 4-0-metil-galluszsav-metilészterből és nitrozo-rezorcinból 4-metoxi-rezazurin-l-karbonsav-melil-észteren keresztül a 4-metoxirezorufin-1-karbonsav-mctil-észtert, UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH = 7,5): Amax= 592 nm; c) 3,5-dihidroxi-benzoesav-metil-észterből és 4-klór-6-nitrozo-rezorcinból 8-klór-rezazurin-l-karbonsav-metil-észteren keresztül a 8-klór-rezorufin-l-karbonsav-metil-észtert; d) 4-0-metil-galluszsav-metil-észterből és 4- -bróm-6-nitrozo-rezorcinból 8-bróm-4-metoxi-rezazurin-l-karbonsav-metil-észteren keresztül a 8-bróm-4-metoxi-rezorufin-l-karbonsav-metilésztert. e) 5-nitro-rezorcinból és nitrozo-rezorcinból 1-nitro-rezazurinon keresztül az 1-nitro-rezorufint; valamint f) rezorcin-5-szulfonsavból és nitrozo-rezorcinból rezazurin-l-szulfonsavon keresztül a rezorufin-l-szulfonsayat. 4. példa Rezazurin-4-karbonsav 1,60 g (10,5 mmól) nitrozo-rezorcint, 1,55 g (10,0 mmól) 2,6-dihidroxi-benzoesavat és 0,86 g (10 mmól) mangán-dioxidot felveszünk 20 ml metanolba. A keveréket 0 °C hőmérsékletre lehűtjük, majd keverés közén 1,06 ml tömény kénsavat csepegtetünk hozzá. A reakcióelegyet még 2 órán át hűtés nJkül tovább keverjük. A kivált vörös színű terméket szűréssel elkülönítjük, metanollal mossuk és szárítjuk. A kitermelés 2,3 g, ami az elméleti kitermelés 85%-ának felel meg. UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH- 7,5): Amax= 614 nm (e - 48 cm2 mól*1): megsavanyítás után Amax- 522 nm (e - 32 cm2 mól1). 5. példa Rezorufin-4-karbonsav A 4. példa szerint előállított rezazurin-4-karbonsavból 2,3 g-ot feloldunk 20 ml víz és 5 ml 8 25%-os ammóniaoldat elegyében. A kék színű oldalhoz jeges hűtés közben 5 g cinkport adagolunk. Ezután a jeges hűtőfürdőt eltávolítjuk és így az oldat lassan szobahőmérsékletre melegszik fel. A redukció lefolyását könnyen követhetjük a színváltozás megfigyelésével (kékből sötétibolya színű lesz), illetve vékonyréteg-kromatográfiával [futtatószer: metanol-etil-acetát (1:1) elegy].A felesleges cinkport kiszűrjük és a reakcióoldatot 5 ml ecetsav—tömény sósav eleggyel megsavanyítjuk. A kicsapódott terméket kiszűrjük, híg sósavval mossuk és vákuumban, kalciumklorid felett szárítjuk. A kitermelés 1,8 g, ami az elméleti kitermelés 82%-a. UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH = 7,5): Amax = 579,4 nm (e = 48,6 cm2 mól*1); megsavanyítás után: Amax= 485,9 nm (e = 34,7 cnr mól*1). Fluoreszcencia: Abszorpció: Amax= 579 nm, Emisszió: Amax= 593 nm. 6. példa l-Metil-rezorufin-4-karbonsav A 4. példában leírtakkal analóg módon 840 mg 2,6-dihidroxi-4-metil-benzoesavat, 760 mg nitrozo-rezorcint, 430 mg mangán-dioxidot és 0,53 ml kénsavat reagáltatunk és így 0,8 g 1-metil-rezazurin-4-karbonsavat kapunk. Az 1-metilrezazurin-4-karbonsavat azután az 5. példában leírtakkal analóg módon l-metil-rezorufin-4- karbonsawá redukáljuk. A kitermelés: 0,4 g. UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH = 7,5): A m£U! =571 nm. 7. példa Rezorufin-4-karbonsav-morfolid 1) N,0,0-triacetil-dihidrorezorufin-4-karbonsav a) változat 5 g (19,4 mmól) rezorufin-4-karbonsavat vagy 5,3 g (19,4 mmól) rezazurin-4-kabonsavat 100 ml 10%-os sósavban 7 g (38 mmól) ón(II)-kloriddaI 0,5 óra hosszat visszafolyatás közben forralunk, miközben az oldat zöldre elszíneződik. Ezután hagyjuk az oldatot lehűlni, majd a kivált dihidrorezorufin-4-karbonsavat nitrogén alatt kiszűrjük és ezt vákuumban difoszfor-pentaoxid felett szárítjuk. Az így kapott nyers terméket 30 percig 20 mg nátrium-acetátot tartalmazó 30 ml ecetsavanhidridben visszafolyatás közben forraljuk. Ezt követően a reakcióelegyet 200 ml jeges vízre öntjük és 14 óra hosszat keverjük. A csapadékot etanol-víz elegyből átkristályosítjuk. így a kívánt vegyületből 4,8 g-ot kapunk, ami 65%-os kitermelésnek felel meg. Olvadáspont: 197- 199 °C. Vékonyréteg-kromatográfia [szilikagél, futtalószer: kloroform-metanol —ecetsav (9:1:0,1)], Rf= 0,33. b) változat 5,1 g (20 mmól) rezorufin-4-karbonsavat 20 ml ecetsavanhidridben 11 g (60 mmól) ón(II)kloriddal 1 óra hosszat 80 °C hőmérsékleten ke5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
