198734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rezofurin szk-ok glikozidjainak előállítására, eljárás glikozidázok és szacharid láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására és diagnosztikumok enzimek kimutatására
1 HU 198734 B 2 verünk. Az elegyet ezután 230 ml jeges vízre önt* jttk, egy óráig keverjük, majd szűrjük és az anyagot az a) változattal analóg módon feldolgozzuk. A kitermelés 5,4 g, ami 71%-nak felel meg. 2) N,0,0-Triacetil-dihidrorezorufin-4-karbonsav-klorid 3,85 g (10 mmól) N,0,0-triacetil-dihidrorezorufin-4-karbonsavhoz 5,4 ml (60 mmól) oxalilkloridot adunk és az elegyet —10 °C hőmérsékletre lehűtjük. Ehhez egy csepp dimetil-formamidot adunk és a reakcióelegyet keverés közben hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni, miközben az eduktum gázfejlődés közben feloldódik. A gázfejlődés befejeződése után az elegyet még 0,5 óra hosszat keverjük, majd bepároljuk. Ezután a maradékot három ízben, alkalmanként 20 — 20 ml vízmentes metilén-dikloriddal felvesszük és szárazra pároljuk. Ilyen módon 4 g nyers terméket kapunk és ezt minden további tisztítás nélkül tovább feldolgozzuk. Vékonyréteg-kromatográfia [szilikagél, futtatószer: kloroform —metanol —ecetsav (9:1:0,1)]. Rf = 0,42; színtelen folt, amely néhány óra múlva vörösre színeződik. 3) N,0,0-Triacelil-dihidrorezorufin-4-karbonsav-tnorfolid 11,3 g (31,4 mmól) nyers savkloridot feloldunk 150 ml vízmentes metilén-dikloridban. Ehhez hozzácsepegtetünk előbb 8,7 ml (63 mmól) trietil-amint és ezt követően 3,3 ml (37,7 mmól) morfolint. Az elegyet további 2 órán át keverjük, majd az oldatot 1%-os citromsavoldattal, nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és vízzel mossuk, ezután a szerves fázist magnézium-szulfát felett szárítjuk, végül bepároljuk. A maradékot etanolon kristályosítjuk. Kitermelés: 8,1 g (ez 63%nak felel meg), a vegyület olvadáspontja: 133- -135 °C (bomlás). 4) Rezorufin-4-karbonsav-morfolid 3,7 g (9 mmól) triacetil-dihidrorezorufin-4- -karbonsav-morfolidot felveszünk 250 ml metanol és 250 ml víz elegyébe. Ehhez 36 ml 1 n nátrium-hidroxid-oldatot és 6,0 g (18 mmól) kálium-[hexaciano-ferrát(III)]-at adunk és az elegyet 14 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezt követően az elegyel sósavval pH ■> 3 értékűre megsavanyítjuk, majd szárazra pároljuk és a maradékot acetonnal eldörzsöljük. A színezékanyag-oldatot 511 ml szilikagélen keresztül aceton futtatószerrel szűrjük. A színezéktartalmú eluátum bepárlása után 2,3 g (80%) terméket kapunk. UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH- 7,5): Am(U- 575 nm, t - 55,000 cm2 mól**. Vékonyréteg-kromatográfia (futtatószer: lásd a 2. pontban), Rf - 0,52. lH-NMR (DMSO-d6): 3,3-3,8 (m, 8H), 6,50 (d, J«2Hz, 1H), 6,64 (d, J-lOHz, 1H); 6,76 (dd, J -10 és 2Hz, 1H); 7,44 és 7,51 (mindegyik d, J - 10Hz, 2H). 8. példa Tetraacetil-rezorufin-l-karbonsav-metil-észter-/3-D-galaktopiranozid és tetraacetil-rezorufin-9-karbonsav-metilészter»ff-D-galaktopiranozid 6,8 g rezorufin-l-karbonsav-metil-észtert (melyet a 3. példa szerint állítottunk elő), 5,75 g ezüst (I)-oxidot, 6,75 g ezüst-karbonátot, 15 g molekulaszitát (0,4 nm) és 10 g a-bróm-tetraacetil-galaktózt 250 ml abszolút kloroformban 4 órán át szobahőmérsékleten keverünk. Ezután az elegyhez további 5 g a-bróm-tetraacetil-galaktózt adunk és egy éjjelen át tovább keverjük. Ezt követően a reakcióelegyet üvegszálas szűrőn keresztül szűrjük, majd bepároljuk. Az olajos nyers terméket 2 liter szilikagélen, kloTO- form — etil-acetát (2:1) eluálószerrel kiomatografáljuk. 2,5 g sárga színű frakciót eiuálunk, melynek Rf értéke 0,28 [magas nyomáson végzett vékonyréteg-kromatográfia (HPTLC) szilikagélen, a fenti futtatószerrel]. Metanollal végzett keverés révén narancsszínű kristályok formájában tetraacetil-rezorufm-9-karbonsav-metilészter-ff-D-galaktopiranozidot kapunk. A kitermelési 1,5 g. 'H-NMR (DMSO-d6): 6= 1,95, 2,03, 2,04 és 2,14 (mindegyik s, 12H); 3,88 (s, 3H); 4,11 (d, J = 7Hz, 2H); 4,51 (t, J=7Hz, 2H); 5,24 (m, 2H); 5,36 (m, 1H); 5,69 (m, 1H); 6,31 (d, J = 2Hz, 1H); 6,97 (d, J = 2Hz, 1H); 7,04 (dd, J = 8,8 és 2,4Hz, 1H), 7,14 (d, J = 2,4Hz, 1H); 7,78 (dd, J = 8,8Hz, 1H). Ezután egy ugyancsak sárga színű frakciót eiuálunk, melynek tömege 1,6 g és az Rf értéke 0,24. Ebből metanollal végzett kristályosítással narancssárga színű kristályok formájában megkapjuk a tetraacetil-rezorufin-l-karbonsav-metil-észter-p-D-galaktopiranozidot. A kitermelés: *.2g*H-NMR (DMSO-d6): 6= 1,95, 2,04 és 2,14 (mindegyik s, 12H); 3,90 (s, 3H); 4,09 (m, 2H); 4,51 (m, 1H); 5,24 (d, J=7Hz, 1H); 5,25 (m, 1H); 5,36 (m, 1H); 5,71 (m, 1H); 6,50 (d, J =2Hz, 1H); 6,83 (dd, J = 10 és 2Hz, 1H); 7,20 és 7,24 (mindegyik d, J = 2Hz, 2H); 7,47 (d, J = 10Hz, 1H). A tiszta termékek között még egy kevert frakció is eluálható, ebből metanolból végzett átkristályosítással 2,5 g kristályos anyagot kapunk, amely a két izomer vegyület keverékéből áll. 9. példa Tetraacetil-rezorufin-4-karbonsav-morfolid-Ó-D-galaktopiranozid és tetraacetil-rezorufin-6-karbonsav-morfolid--Ó-D-galaktopiranozid 3,26 g (10 mmól) rezorufin-4-karbonsav-morfolidot a 8. példában leírtakkal analóg módon galaktozidálunk. A nyers terméket 1 liter szilikagélen, etil-acetát - aceton (3:1) futtatószerrel kromatografáljuk. Ilyen módon 0,9 g tctraacetil-rczorufin-6-karbonsav-morfolid-g-D-galaktopi-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
