198734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rezofurin szk-ok glikozidjainak előállítására, eljárás glikozidázok és szacharid láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására és diagnosztikumok enzimek kimutatására
1 HU 198734 B 2 ró vízfürdőn melegítünk. Ezután további 20 ml fenti ammóniaoldalot, 7 ml fenti hidrogén-szulfit-oldatol és 20 ml vizet adunk hozá és a reakcióelegyet további 30 percen át melegítjük. Az átalakulást az elegy színváltozásával (kékből vörös lesz), vagy vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal követjük. A reakció teljes végbemenése után az elegyhez 10 ml 32%-os sósavoldatot adunk pH = 5 érték éeléréséig. Ezután a reakcióoldatot egy napig hűtőszekrényben állni hagyjuk. Ezt követően a barnás színű csapadékot leszívatjuk, 4 pH-jú jéghideg sósavoldattal mossuk és 110 °C hőmérsékleten megszárítjuk. A kitermelés 7,8 g (36,7 mmól), ami az elméleti kitermelés 85%-ának felel meg. b) A rezorufin glikozidálása rezorufin-/?-D-galaktopiranoziddá A fenolos hidroxilcsoportokon végzett glikozidálásl a tetraacetát közbenső fokozaton keresztül az alábbiakban leírt eljárással valósítjuk meg: 2,13 g (10 mmól) finoman porított rezorufint, 4,12 g (10 mmól) acetobromo-a-D-galaktózt (Sigma, München), 1,16 g (5 mmól) ezüst(l)-oxidot (Fluka, Buchs, Svájc), 5 g kalciumszulfátot (CaS04 . 1/2H2ö; Drierit), néhány szemcse jódot és 50 /d kinolint 50 ml melilén-dikloridban szobahőmérsékleten 40 óra hosszat keverünk. A rezorufin 40%-a átalakul rezorufin>/?-D-galaktopiranozid-tetraacetáttá. Ennek a reakciónak az ellenőrzését is vékonyréteg-kromatográfiás eljárással végezzük. A szilárd alkatrészeket redős szűrőpapír segítségével, majd centrifugálással elválasztjuk, ezután a metiléndikloridot forgó bepárlóberendezésben eltávolítjuk. A rezorufin-/?-D-galaktopiranozid-tetraacetát barnássárga szirup formájában marad vissza. A kitermelés kb. 2 g, ami az elméleti kitermelés 36%-a. A 2 g rezorufin-/?-D-galaktopiranozid-tetraacetátol minden további tisztítás nélkül 80 ml vízmentes metanollal felvesszük. Kis darabokban levő 0,5 g nátriumsót külső jeges hűtés közben feloldunk 20 ml vízmentes metanolban. Ezután keverés és külső jeges hűtés közben 6 —8 ml fenti metoxidoldatol 1 ml-es részletekben 30 perc leforgása alatt hozzáadunk a rezorufin-/?-D-galaktopiranozid-tetraacetát-oldathoz és a dezacetilezésl vékonyréteg-kromatográfiás eljárással követjük. A kivált, narancsszínű rezorufin-/?-D- galaklopiranozidot leszívatjuk és kevés jéghideg metanollal mossuk. Körülbelül 1 g nyers terméket kapunk, ami az elméleti kitermelés 70%ának felel meg. Ezt a nyers terméket metanolból átkristályosítjuk, majd 60 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten szárítjuk. Ilyen módon 0,2 g tiszta terméket kapunk. A reakció lefolyásának ellenőrzésére szolgáló összes vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatot Kiesclgel 60 (Merck, Darmstadt) szilikagéllemezen végezzük és ennek során futtatószerként metilén-diklorid — metanol (9:1) elegyet használünk. Ilyen rendszerben kapjuk: az alábbi Rf értékeket Rezorufin 0,40; Rezazurin Rezorufin-/?-D-galakto-0,35; piranozid-tetraacetát Rezorufin-/?-D-galakto-0,90; piranozid 0,10. A rezorufin-/?-D-galaktopiranozid néhány fizikaijellemzője: lH-NMR (DMSO-d6): í- 3,4-3,8 (m, 6H); 4,5, 4,65, 4,85 és 5,2 (mindegyik "széles váll", 4H); 5,04 (d, J = 7,8Hz, 1H); 6,25 (d, J = 2Hz, 1H); 6,75 (dd, J = 10 és 2Hz, 1H); 7,1 (m, 2H); 7,48 (d, J = 10Hz, 1H); 7,73 ppm (d, J = 10Hz, Hl). UV/VIS (0,1 mólos kálium-foszfát-puffer, pH 7,55): Amax= 469 nm. 2. példa Rezorufin-/?-D-Klükozid 2,13 g (10 mmól) rezorufint (előállítását lásd az 1. példa a) pontjában), 4,11 g (10 mmól) acetobromo-a-D-glükózt és 3,64 g (10 mmól) hexadecil-trimetil-ammónium-bromidot 4 órán keresztül 11,5 ml 1 n nátrium-hidroxid-oldat és 50 ml kloroform keverékében, visszafolyatás közben forralunk. Ezután az elegyet szárazra pároljuk, majd etil-acetáttal eldörzsöljük. Az etil-acetátos oldatot újból szárazra bepároljuk, majd a kapott maradékot 20 ml etanollal felvesszük. Ebből az oldatból kiválik a tetraacetil-rezorufin-/?-D-glükozid, melyet aktív szén hozzátétele mellett metanolból átkristályosítunk. Dezacetilezés céljából az anyagot 10 ml metanollal felvesszük és szobahőmérsékleten végzett 2 órás keverés után a kivált terméket leszívatjuk, majd megszárítjuk. A kitermelés 50 mg. ‘H-NMR (DMSO-d6): 5= 3,15-3,80 (m, 6H); 4,5-6,5 (széles, 4H); 5,12 (d, J = 6,9Hz, 1H); 6,29 (d, J = 2,0Hz, 1H); 6,80 (dd, J = 9,6 és 2,0 Hz, 1H); 7,12 (dd, H = 8,5 és 2,0Hz, 1H); 7,16 (d, J = 2,0Hz, 1H), 7,55 (d, J = 9,6Hz, 1H); 7,80 (d, J =8,5Hz, 1H). 3. példa Rezorufin-l-karbonsav-metil-észter 50 g nitrozo-rezorcint, 53,3 g 3,5-dihidroxi-benzoesav-metil-észtert és 28,0 g mangán-dioxidot (barnakő) 500 ml metanolban oldunk, illetve szuszpendálunk. Ehhez jeges hűtés és keverés közben, 5 —10 8C hőmérsékleten hozzácsepegtetünk 34,4 ml tömény kénsavat. A hűtőfürdő eltávolítása után az elegyet még két órán keresztül tovább keverjük. Ezután hűtés közben 200 ml vizes ammóniaoldatot adunk az elegyhez. A kivált csapadékot üvegszálas szűrőn végzett szűréssel kiszűrjük. A szűrlethez 5 —10 °C hőmérsékleten részletekben 10 g cinkport adagolunk, majd a reakcióelegyet szobahőmérsékleten addig keverjük, amíg a redukció teljesen végbemegy (vékonyréteg-kromatográfiás ellenőrzés, futtatószer: etil-acetát — metanol (4:1) elegy, a reakció5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
