198734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rezofurin szk-ok glikozidjainak előállítására, eljárás glikozidázok és szacharid láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására és diagnosztikumok enzimek kimutatására
1 HU 198734 B 2 rint homogén és heterogén mérési elrendezést, egy további csoportosítás alapján pedig kompetitiv és nem kompetitiv kísérleti alapelvet lehet megkülönböztetni. Valamennyi mérési aiapelv szerint azonban vagy enzim-antigén, vagy enzim-antitest konjugálumokkal dolgozunk. Az enzimatikus indikátorreakció az összes enzim immunoassay-módszer esetén közös. Ilyen célra alkalmas enzimek (indikátorenzimek) például a glikozidázok, különösen alkalmas a /?-D-galaktozidáz. Az ilyen enzimimmunoassay méréseknél a glikozidázokat a szokásos módszerrel határozzuk meg, amenynyiben egy alkalmas szubsztrátumot adunk hozzá, amelyet az enzimatikus hasítást követően ismert módon folometrikus vagy fluorometrikus módszerrel mérünk. Az ilyen enzimimmunoassay meghatározásoknál a glikozidáz-tesztrendszer tökéletesítése ugyancsak jelentős előnyöket eredményez. így 1. a nagyobb érzékenység folytán itt is lehetséges a kimutatás határértékének további csökkentése, a rövidebb reakcióidő és a szükséges próbamennyiség csökkentése, ezáltal a próba többi komponense által okozott zavarok is mérsékelhetők; 2. a kedvezőbb mérési hullámhossz bizonyos reakciófellételek fennforgása esetén csökkenti a módszer zavarok iránti hajlamát, amit az oldhatatlan komponensek, például a rendszer zavarosodása okoz. A diagnosztikai készítmény egy vagy több találmány szerinti (1) általános képletű szubsztrátumot, emellett valamilyen alkalmas pufferrendszert, adott esetben további alkalmas hozzátétanyagokat, mint például nedvesítőszereket, stabilizátorokat stb. tartalmaz. Ezek a hozzátétanyagok egyébként az ilyen jellegű diagnosztikai készítményeknél szokásosan használt anyagok lehelnek. A diagnosztikai készítmény kiszerelési formája lehet oldat, liofilizátum, porkeverék vagy reagenstabletta, illetve az valamilyen szívóképes hordozóanyagra felvitt készítmény alakjában is előfordulhat. Amennyiben a találmány szerinti diagnosztikai készítmény oldat formájában van, úgy az oldat előnyösen a mérés lefolytatásához szükséges összes reagenst tartalmazza. Oldószerként a víz, vagy víz és egy vízoldható szerves oldószer — mint például metanol, etanol, acélon és diraetil-formamid — elegye jön tekintetbe. Az eltarthatóság szempontjából előnyös lehet, ha a méréshez szükséges reagensekből két vagy több oldatot készítünk és ezeket csak közvetlenül és tényleges vizsgálat előtt keverjük össze egymással. Liofilizátum formájában levő diagnosztikai készítmény előállítására az oldatot fagyasztva szárítjuk. Az oldat a meghatározáshoz szükséges összes reagensek mellett még szokásosan használt vézképzőket, így például poli(vinil-pirrolidon)-t és esetleg további töltőanyagokat, mint például mannitot, szorbitot vagy xilitet tartalmaz. A liofilizált készítmény összes tömege 5-20 mg, előnyösen 10 mg. A porkeverék vagy reagenstabletta formájában levő diagnosztikai készítményeket úgy állíthatjuk elő, hogy a teszthez szükséges anyagokat a galenikus készítményekhez szokásosan használt hozzátétanyagokkal összekeverjük és granuláljuk. Az ilyen jellegű hozzátétanyagok például cukoralkoholok, így mannit, szorbit vagy xilit, illetve egyéb oldható inert vegyületek, így polietilénglikolok vagy poli(vinil-pirrolidon) lehetnek. A porkeverékek és a reagenstabletták végső tömege általában kb. 30 — 200 mg, előnyösen 50- — 80 mg között van. Tesztcsík alakjában levő diagnosztikai készítmény előállítása céljából valamilyen szívóképes hordozót, így szűrőpapírt, cellulózt vagy gyapjú típusú műszálat impregnálunk egy oldattal, amely tartalmazza a szükséges és tesztcsíkok előállításához szokásosan használt reagenseket, valamilyen illékony oldószerben, mint például vízben, metanolban, etanolban vagy acetonban oldva. Ez egyetlen impregnálási lépésben is történhet, de gyakran az bizonyult célszerűnek, ha az impregnálási több lépésben valósítjuk meg és ennek során olyan oldatokat használunk, melyek a diagnosztikai készítményhez szükséges anyagoknak csak egy bizonyos részét tartalmazzák. így például az első lépésben a puferanyagokat és a többi vízoldható hozzátétanyagokat tartalmazó vizes oldallal impregnáljuk a hordozót és ezt követően egy második lépésben végezzük a glikozidáz-szubsztrátum-oldattal történő impregnálást. A kész tesztcsíkokat vagy ebben a formában használjuk, vagy önmagában véve ismert módon valamilyen nyélre ragasztjuk fel őket, vagy előnyösen a DBP 2,118,455. számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerint egy műanyaglap és egy kisnyílású háló között rögzítjük. Az alábbiakban következő példák bemutatnak néhány eljárásváltozatot a találmány szerinti vegyületek előállítására szolgáló sokféle lehetséges eljárás közül és példa jelleggel bemutatják a rezorufinszármazékok új glikozidjainak alkalmazását is, glikozidázok és szacharid-láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására, illetve kimutatására. Ezek a példák azonban semmiféle formában sem korlátozzák a találmány oltalmi körét. 1. példa Rezorufm-fl-D-galaktopiranozid a) Rezorufm előállítása A rezorufint a rezazurin nevű oxidációs termékéből kiindulva állítjuk elő, melyet kellően tiszta minőségben be lehet szerezni a kereskedelemben, Az előállítást a Nietzki és szerzőtársai [Bér. Dtsch. Chera. Ges., 22, (1889) 3020 - 3028. oldal] által leírtak szerint végezzük. Úgy járunk el, hogy 10 g (43 mmól) rezazurint [Fluka, Buchs, Svájc] egy hengerpohárban 50 ml 25%-os ammónia-oldattal, 25 ml 37%-os nátrium-hidrogén-szulfit-oldattal és 50 ml vízzel 30 percig for-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
