198708. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4,5,6-szubsztituált-N-(szubsztituált-fenil)-2-pirimidin-amin származékok és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 198708 ß 2 Immunopharmacology and Treatment, Second International Symposium, szerkesztek L. M. Lichtenstein és K. F. Austen, Acedemic Press, New York, 51 (1979); és Bell, S. C. és mlársai, Annual Reports in Medicinal Chemistry, Í4, 51, szerkesztő H.J. Hess, Academic Press, New York, (1979), A találmány szerinti eljárással előállított új vegyületek vizsgálatát Lichteinstein, L. M. és Osler A. G. módszere szerint végeztük (J. Exp. Med., 120, /1964/, 507 — 530). A mérés arra irányult, hogy meghatározzuk a vegyületek közvetítő-(hisztamin)-felszabadulását gátló hatását az immunogén úton stimulált basophil sejtekből. Alkalmazott reagensek: lOx koncentrált trisz puffer; 140,3 g nátrium-klorid, 7,45 g trizma-trisz-pre-set, reagent grade, pH = 7,6 25 °-on (Sigma Chemical Co.) vízben oldva és 2 literre kiegészítve. Human albumin: Sigma Chemical Co. gyártmány, (30 mg/ml). Kalcium és magnézium törzsoldat: 0,075 mól és 0,5 mól koncentrációjú, kalcium-klorid-dihidrátját, ill. magnézium-klorid-hexahidrát oldat. Trisz-A-puffer: 10 ml lOx trisz-puffer és 1,0 ml humán albumin 100 ml-re vízzel hígítva. Trisz-ACM puffer: 10 ml lOx trisz-puffer, 1,0 ml humán albumin, 0,8 ml kalcium-törzs és 0,2 ml magnézium törzs 100 ml-re vízzel hígítva. Nyúl antihumán IgE: Behring Diagnostic gyárim. Végső koncentráció általában 10 /*g protein/ml. Poratka (Dermatophagoides Farinae) kivonat: Erős allergen extraktum 1:100 (t:tf), Hollister-Steir Labs. gyártmány. Általában 1:1000 — 1:10000 arányban hígítva kerül felhasználásra. Egyéb allergének: Intradermális vagy intramuszkuláris oldatok hiposzenzibilációhoz, Hollister-Steir Labs. gyártmány. Végső koncentráció 1 PNU/ml. Leukocyták elválasztása emberi vérből Olyan egyedből, amelynek véréről ismert a hisztamin-felszabadulás anti-IgE, ambrózia antigén vagy más speciális allergénnel szemben, leveszünk 80 ml vért és heparinnal kezelt tubusba tesszük. A 80 ml vért elkeverjük 20 ml, 0,6 g dextrózt és 1,2 g dextránt tartalmazó sóoldattal, majd szobahőmérsékleten két 50 ml-es polikarbonát csőben addig centrifugáljuk, amíg a vörös vérsejtek és a plazma között éles elválasztási felület képződik (60 — 90 perc). A csövekből a felső plazmaréleget leszívatjuk és 50 ml-es polikarbonál csőbe tesszük, majd 8 percig 4 °C hőmérsékleten 110 G mellett centrifugáljuk. A felülúszót óvatosan leöntjük és az alsó sejtrészt 2-3 ml trisz-A-puffcrben, szilikonozolt Pasteur pipettát alkalmazva szuszpendáljuk. A reszuszpenziót úgy végezzük, hogy a pipettában a folyadékot óvatosan le-föl mozgatjuk, addig amíg megfelelő sejlszuszpenziót nyerünk. Ezután annyi trisz-A-puffert adagolunk, hogy a térfogat 45 ml legyen, majd a csövet ismételten 110 G mellett 8 percig 4 °C hőmérsékleten centrifugáljuk. A felülúszöi leöntjük, az alsó sejtrészt ismét reszuszpendáljuk a fentiek szerint. A felülúszót leöntjük, az alsó részt szuszpendáljuk 2-3 ml trisz- ACM pufferban. 0,2 ml anti-IgE antigént önmagában vagy a vizsgálandó vegyülettel együtt reakciócsőben, 37 °-on inkubálunk és a szintéz 37 ®-ra melegített szuszpenzióból 1 ml-es alikvot részt hozzáadunk és az inkubálást a fenti hőmérsékleten még 60 percig folytatjuk, időközönként gyenge rázást alkalmazva, hogy a szuszpenzió szélülepedését megakadályozzuk. A reakció végbemenetele után a csöveket 4 °C-on 10 percig centrifugáljuk 1500 ford/perc sebességgel a sejtek kiúlepítése érdekében. Ezután 1 ml felülúszót 12x75 mm-es polietilén csőbe teszünk és hozzáadunk 0,2 ml 8%-os perklórsavat. A kontroll cső antigén vagy anti-IgE kivételével minden fenti anyagot tartalmaz. A végső összetétel 0,24 ml 8%-os perklórsav, 1 ml sejtszuszpenzió és 0,2 ml puffer. Minden mintából centrifugálással eltávolífottuk a kivált fehérjét. Hisztamin-felszabadulás meghatározása automatikus fluorometriás módszerrel. A módszer a következő helyen van leírva: Siraganian, R. P., in Anal. Biochem., 57, 383 (1974) és J. Immunol. Methods, 7, 283 (1975), amely Shore, P. A. és mtársai, (J. Pharmacol. Exp. Ther., 217, 182 /1959/) módszerén alapul. Az automatizált rendszer a következő Tcchnicon Autoanalyzer II komponensekből áll: Sampler IV, Dual Speed Proportioning Pump III, Fluoronephelometer (7 — 60 primer és 3 —74 szekunder szűrő), rekorder és nyomtató. A vezetékrendszer a Siraganian által leírtak szerinti volt a következő eltérésekkel: a dializálót elhagytuk, a szívócsöveket egyetlen, nagykapacitású eloszlószivaltyún vezettük keresztül és kétszeres mennyiségű mintát alkalmaztunk. Az automatikus mérés a következő lépésekből állt: extrahálás alkálisó oldalból bulanolba, visszaextrahálás hígított sósavba heptánnal, hisztamin és o-fláldialdehid (OPT) reakciója magas pH-értéken és a kapott OPT-adduktum átalakítása stabil fluoroforrá foszforsavval. Az így kapott reakcióterméket visszük be a fluorométerbe. A teljes skála megfelelő 50 ng hisztaminna) 0,5 ng felbontással. _____t____ ' A nisztamin-felszabadulási teszt kiértéfcerése A műszerkonstans értékét minden minta esetében levonjuk a hisztamin ng értékből, majd minden minta esetében az ng hisztamin értéket elosztjuk a három teljes minta átlagértékével, így megkapjuk a százalékos felszabadulás-értéket. A vakpróba (spontán felszabadulás) nem tartalmaz sem antigént sem vizsgálandó vegyületet, a kontroll minta tartalmaz antigént de nem tartalmaz vizsgálandó vegyületet. A vakpróbák (három párhuzamos) átlagértékét levonjuk a kontrollok és vizsgálandó vegyületek esetében meghatározott százalékos felszabadulásból. Kiszámítjuk a kontroll és vizsgálandó vegyületeket tartalmazó minták átlagát és az eredményt a vizsgálandó vegyületre a kontrolihoz viszonyít5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
