198513. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antikoaguláns hatású peptid és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 A találmány tárgya eljárás új, H-Gly-Asp PheGlu-DCys-Ile-Pro-X-Glu-Tyr-Leu-Gln- OH (I) általános képlett! peptidek, dimerjeik, valamint a monomert és a dlmet tartalmazó elegyek előállítására. A találmány olyan új, ciklikus peptidek előállítására vonatkozik, amelyek antikoaguláns hatással rendelkeznek. Az antikoaguláns szerek alkalmas terápiás hatóanyagok például akut mélyvénás trombózis, tüdőembólia, akut artériás embólia, szívizom infarktus és elszórt éren belüli koaguláció gyógyszerészeti kezelésére. Az antikoaguláns szerek megelőző alkalmazása lehetővé teszi a reumatikus vagy érelmeszesedéses szívbetegségekben szenvedő betegek esetében az embólia visszatérésének megakadályozását és megakadályozza sebészeti beavatkozások során bizonyos thrombus-embólia kialakulását. Antikoagulánsok adagolása történik szrvkoszorú verőér és agyérrendszeri betegségben szenvedők kezelése esetében is. Az artériás trombózis, különösen a szívizmot és az agyat ellátó artériák esetében az elhalálozás egyik fő oka. A hirudin egy 65 egységből álló polipeptid, amelyet pióca tnyálmirigyből izoláltak. Ez egy olyan antikoaguláns, amely thrombin specifikus inhibitor hatással rendelkezik. A hirudin ugyan igen jó hatékonyságú, de a pióca nyálmirigyéből izolált anyagnak klinikai alkalmazása mennyiségénél fogva limitált. Ezen túlmenően az izolált anyag drága és alkalmazását, mint minden ilyen méretű fehérje adagolását allergiás reakciók követik. A szerzők felfedezték, hogy a hirudin egy spclfikus részlete felelős, legalább részben, antikoaguláns hatásáért. A részlet molekulát kémiai úton előállítottuk, és ennek bizonyos ciklusos analógjairól kitűnt, hogy a thrombin felismerési helyére kötődnek, de nem kötődnek az ettől térben elkülönülő thrombin enzimatíkus hasítási helyre. A szintetikus peptidek kötődése tökéletesen meggátolja a flbrinogén megkötődését a thrombin felismerési helyekre, ami előfeltétele a fibrin keletkezésnek és a vérrög képződésnek. A találmány szerinti eljárással előállított peptidek jelentős antikoaguláns aktivitással rendelkeznek és az a szokatlan jellemzőjük, hogy csak a thrombin felismerési helyhez kötődnek és nem kötődnek a thrombin enzimatikus hasítási helyéhez, lehetővé teszi egy tudományosan érdekes és terápiásán jelentős antikoaguláns gyógyítási eljárás megvalósítását. A találmány tárgya eljárás H-Gly-Asp-Phe-Glu-DCys-Ile-Pro-X-Glu-Leu-Gln-OH (I) általános képletű peptid és (H-Gly-Asp-Phe-Glu-DCys Ile-Pro-X-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH)2 (II) (II) általános képletű dimer és ezek elegyének előállítására, ahol az általános képletekben X jelentése Cys vagy Pen csoport. A leírásban az aminosavak rövidítésére az alábbi jelöléseket használjuk: Gly- glicin Leu- íeucin Ile- izoleucin Pro- prolin Phe- fenil-alantn Cys- cisztein Tyr- tirozin Gin- glutamin Asp- aszparginsav Glu- glutamlnsav Pen- penicillamin (béta.béta-dimetil-cisztein) DCys- D-cisztein. A glicin, a Íeucin, az Izoleucin, a fenil-alanln, a tirozin, a cisztein, a prolin az aszparginsav, a glutaminsav és a glutamin természetesen előforduló aminosavak. A Tyr, Phe, Leu, lie és Pro lipofil aminosavak. A természetesen előforduló aminosavak a glicin kivételével királis szénatomot tartalmaznak. Hacsak másképp nem jelezzük, a megadott optikailag aktív aminosavak alatt ezek Lkonfigurációját értjük. A dimer elnevezés alatt olyan peptideket értünk, amelyeket két lineáris pepiidnek a B csoporton keresztül történő kötésével a találmány szerinti eljárás ciklizációs művelete során nyerünk. Az így keletkezett termék molekulaképlete pontosan a kétszerese a monomer képletének. A jelen leírásban, hacsak másképp nem jelöljük, a dimer elnevezésbe mindig beleértendők a dimerek és ezek keverékei Is. A ciklizációs lépésben keletkező monomer és dimer keveréke azonban jól ismert eljárásokkal könnyen elválaszthatók egymástól, de elválasztás nélkül is alkalmazhatók thrombin ellenes hatású anyagként. A szóbanforgó peptideket szilárd fázisú szekvenciális eljárással, automata peptid szintetizátor alkalmazásával állítjuk elő. Ebben az esetben az alfa-aminocsoporton védett aminosavat kötjük a gyanta hordozóhoz. Az alkalmazott gyanta hordozó lehet bármely polipeptid szilárd fázisú előállításban szokásosan alkalmazott gyanta, és előnyösen polisztlrol, amely körülbelül 0.5-3% divinil-benzol keresztkötéseket tartalmaz, és amely vagy klórmetilezett vagy hidroximetilezett, amely funkciós csoportok alkalmasak a kezdetben bevezetett a-aminocsoporton védett aminosawal való észterkötés létrehozására. Egy hidroxil-metil-gyantát írt Bodanszky és csoportja Chem.Ind. (London), 38, 1597-98 (1966.) közleményében. Egy klór metilezett gyanta kereskedelemben kapható, a Bio Rád Laboratories, Richmond, California terméke. A klór-metilezett gyanta előállítási eljárást közölték Stewart és mtsai. Solid Phase Paptide Synthesis (Freeman and Co., San Francisco 1969), Chapter 1, pp. 106 közleményükben. A védett aminosavat a gyantához Gisin, Helv, Chim. Acta, 56, 1476 (1973) közleményében leírt eljárása szerint kapcsolhatjuk. Számos gyantához kötött védett aminosav kereskedelemben kapható. Például egy olyan polipeptid találmány szerinti előállítása során, amelyben a karboxil terminális aminosav egy t-butoxi-karbonil-csoporttal (Boc) védett, kötünk egy benzilezett, hidroxilmetilezett fenil-acetamido-metil gyantához (PAM), amely gyanta kereskedelemben kapható. Miután az a-aminocsoporton védett aminosavat a gyanta hordozóhoz kötöttük, alkalmas eljárással, például dlklórmetánban trifluor-ecetsavat alkalmazva, tiszta trifluor-ecetsavat alkalmazva, vagy dioxános sósavat alkalmazva, a védőcsoportot eltávolítjuk. A védőcsoport eltávolítását körülbelül 0 °C-szobahőmérséklflt közötti hőmérsékleten végezzük. Más speciális a,aminosav védőcsoport eltávolításra alkalmas, tandrad hasítási eljárások is alkalmazhatók. Miután a-aminocsoport védőcsoportot eltávolítottuk, a többi aminocsoporton védett aminosav a kívánt sorrendben 198.51 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
