198393. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hatóanyagként pirimidin-nukleozid származékokat tartalmazó, hepatitisz kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására
1 198 393 2 lek mellett. A Lineweaver-Burk ábrázolás szerint a HBV DNS-polimerázt az ACVTP, FIACTP és BVdUTP kompetitiven gátolja a dGTP, dCTP, illetve dTTP beépítésében. Hasonló eredményeket kapunk a WHV DNS-polimerázzal is. A dGTP, dCT? és dTTP értékeit, és az ACVTP és BVdUTP K: értékeit mindkét víms DNS-polimeráz esetén meghatároztuk. A WHV DNS-polimeráz ACVTp-vel, FLACTP-vel és BVdUTP-vel szembeni affinitása kisebb, mint a HBV DNS-polimerázé, azonban a K^K- értéket összemérhetők a két enzim esetén. A három nukleozid-analóg virális DNS-szintézisre kifejtett hatásának vizsgálatára meghatároztuk a HBV DNS- polimeráz idő függését. Jelzett szubsztrátként/3H/-dATP-t használtunk. A reakcióidő 60 percen át lineáris mind a négy nukleozid-trifoszfát szubsztrát esetén. Ha a reakcióelegyből elhagyjuk a dTTP-t, dCTP-t vagy dGTP-t, nem tapasztalunk jelentős DNS-szintézist. Ha a dTTP helyett BVdUTP-t használunk, a virális DNS-szintézisek a kontroll érték 46 %-át érik el, 3 órás reakcióidő alatt. Ez az érték 4 órás reakció alatt az optimális érték 67 %-át éri el. Azonban hasonló kísérletben nem észlelünk jelentős DNS-szintézist, ha a dTTP-t ara-TTP-vel helyettesítjük. Ha a fenti kísérletben dCTP helyett FIACTP-t használunk, a [3H]-dAMP kis mértékben épül be (3 órás reakcióidő alatt a kontrollnak kb. 10%-a), míg dCTP helyett ara-CPT-t használva nem tapasztalunk jelentős beépülést. A dGTP ACVTP-vel való helyettesítése nem serkenti a polimerizációs folyamatot. A fenti különféle analógok hatékonyságát a HBV és WHV DNS-polimerázok szubsztrátjainak helyettesítésében összefoglalva megállapíthatjuk, hogy mindkét enzim számára a BVdUTP a leghatékonyabb szubsztrát-helyettesítő. A BVdUTP-vel, mint szubsztrát-helyettesítővel szintetizált DNS-t agarózgél-elektroforézissel analizáltuk. A BVdUTP-vel csak részleges kitöltést kapunk a HBV vagy WHV DNS egyes szálú régiójában. Az ACVTP hatását a HBV DNS-szintézisre szintén vizsgáltuk, kinetikai kísérletben. Jelzett szubsztrátként (3H]-dTTP-t használunk. A reakciót dGTP nélkül indítjuk el, vagy dGTP helyett 5 /umól ACVTP-t használunk. A fenti körülmények között nem mértünk [3H]-dTMP beépülést. A reakció kezdete után 120 perccel lOO/umól/l koncentrációban dGTP-t adunk a reakcióelegyhez. Abban a mintában, amelyben a reakciót dGTP nélkül indítottuk, a dGTP hozzáadására a DNS-szintézis a várt módon fokozódik. Azonban abban a mintában, amelyben a dGTP helyett 5 pmól ACVTP-t használtunk, 100 jumól dGTP hozzáadására sem észlelünk DNS-szintézist. összehasonlító vizsgálatban, mikor a reakció kezdetén beadagoljuk az azonos mennyiségű (5 /miól) ACVTP-t és dGTP-t (100 jumól), jelentős DNS-szintézist tapasztalunk. Hasonló kísérletet végeztünk ara-ATP-vel és ara-CTP-vel is. Mindkét esetben azt tapasztaltuk, hogy ha 120 perces reakcióidő után az elegyhez a normál szubsztrátot hozzáadjuk, az analógok jelenlétében fokozódik a HBV DNS-szintézis. így megállapíthatjuk, hogy a természetes trifoszfát-szubsztrát, a dGTP helyett az ACVTP hozzáadása nem fokozza a DNS-szintézist, hanem úgy tűnik, hogy leáll a további lánchosszabbodás. Az antivirális hatással rendelkező nukleozid-analógoknak a sejtben trifoszfát-származékokká kell alakulniuk, hogy a virális DNS-szintézist befolyásolni tudják. Ismert, hogy a CVTP, a BVdUTP és FIACTP előnyösen gátolják a herpes simplex vírus DNS-polimerázt, és ennek alapján részben magyarázható az ACV, BVdUTP és FIAC nukleozid-analógok szelektív antivirális aktivitása. A fent ismertetett kísérleti eredmények szerint mind a három vegyidet gátolja a HBV és WHV DNS-polimerázokat, és a gátlás a megfelelő természetes trifoszfát-szubsztrátokra nézve kompetitiv jellegű, összehasonlítottuk az ACTP, BVdUTP, FIACTP és két másik nukleotid-analóg, az ara- CTP és ara-TTP inhibitor-aktivitását. A HBV és WHV DNS-polimerázra kifejtett inhibitor-hatás a következő sorrendben csökkent: FMAUTP, FIACTP, BVdUTP, ara- TTP, ACVTP és ara-CTP. Az ACV HBV replikádéra kifejtett in vivo gátló hatását kimutatták, krónikus hepatitisz B-ben szenvedő betegeken [Weller és munkatársai: Lancet, 1, 273 (1982); Weller és munkatársai: J. Antimicrob. Chemother. 11, 223 -231 (1983)]. Azonban az, hogy az ACV in vivo hatása kapcsolatban lehet az ACVTP HBV DNS-polimerázra kifejtett in vitro gátló hatásával', nem volt bizonyítva, mivel az endogén DNS-polimeráz szerepe a HBV replikációban a fertőzött sejtekben ismeretlen volt. Ezenkívül, a herpeszvírus ellenes szerek, mint az ACV, FIAC és BVdU hatásában jelentős mozzanat a fenti analógok szelektív foszforilezése a fetőzött sejtben, a herpeszvírus által kódolt timidin-kinázzal. Eddig nem mutattak ki virális timidinkináz aktivitást a HBV vagy WHV esetén. így az in vitro kísérleti eredményekből nem lehet a fenti anyagok lehetséges in vivo alkalmazására közvetlenül következtetni. Tehát, mivel az egyes vegyületek hatásmódja különböző, nem lehet előre következtetni az egyik vegyület in vivo aktivitásából a másik vegyület in vivo aktivitására. Mivel nem rendelkezünk a HBV tenyésztésére alkalmas sejttenyésztő-rendszerrel, a HBV endogén DNS-polimeráz gátlásának tanulmányozása az egyetlen használható módszer a lehetséges HBV-eüenes szerek felismerését. A fentiek alapján a FIAC-t és vele rokon, herpeszellenes szerként hatásos pirimidin-nukleozid-származékokat [5-szubsztituált-l-(2’-dezoxi-2’-szubsztituált-/J-D-aiabino-furanozil)-pirimidin-nukleozid-származékokat] használjuk hepatitisz B fertőzés kezelésére emberben, illetve mormota hepatitisz virus fertőzés kezelésére mormotában. Választásunk azért esett a FIAC-ra és a vele rokon vegyületekre, mivel hatásuk a többi in vitro vizsgált vegyületekkel összehasonlítva nagyobb. Várható, hogy a fenti vegyületek aktivitása lényegesen nagyobb, mint a más szerkezetű, fent ismertetett módon összehasonlításként vizsgált vegyületek aktivitása. A vizsgálatokat emberen és mormotán végezzük. A vizsgált pirimidin-nukleozid-vegyületek az alábbiak: FIAC, FIAU, FMAU és FEAU. A fenti vegyületek vízben oldhatók, így a betegek kezelésére vizes, vagy víz alapú oldatokat használunk előnyösen. Az oldhatósági adatok a következők: Vegyület Oldhatóság (mg/ml) Móltömeg FIAC 7,2 21 *C-on 371 FMAU 66 24 *C-on 260 81 28 *C-on FIAU 4 28 *C-on 372 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
