198218. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bázikus proteinek izolálására protein-elegyekből
1 HU 198218 B 2 A találmány tárgya eljárás bázikus proteinek elkülönítésére proinzulin és/vagy származékai enzimatiku8 hasításakor keletkező proteinkeverékekböl. Humáninzulin géntechnikai előállításánál az inzulin bioszintézisét egy prekurzoron, a proinzulinon keresztül hajtják végre, melynek során a B-láncot a C-peptiden ( = Connecting Peptide) át kapcsolják össze az A-lánccal. Az Escherichia coli révén végbemenő géntechnológiai folyamatban olykor előbb egy fúziós proteint kapunk, melynél a proinzulinhoz még egy idegen protein, például ß-galaktozidáz kapcsolódik. Ezt az idegen proteint a további feldolgozás előtt először le kell hasítani, pl. halogén-cianiddal (1. DE-OS 34 40 988). A halogén-cianiddal való hasítás után a cisztein-maradékot szulfitolizissel (nátrium-szulfittal és nátrium-tetrationáttal való kezeléssel) S-szulfonáttá alakítjuk. Ebből a formából a molekulát reduktív úton (például merkapto-etanollal való kezeléssel bázikus oldatban) a diszulfid-hid képzése közben natív térszerkezetébe viszik át. A proinzulinból illetve pre-proinzulinból (a = = proinzulin származéka; a .pre* előtag a proinzulin N-terminusán lévő egy vagy több kiegészítő aminosavra vonatkozik) enzimatikus hasítással (pl. tripszinnel) egy inzulinprekurzort, az inzulin-Arg-B31-B32-t és C-peptidet tartalmazó hasítási keveréket állítanak elő. A keverék ezek mellett még néhány mellékterméket, mint pl. inzulin-Des-Thr-B30-t, inzulin-Arg-B31-t valamint nem teljesen lehasadt intermediereket tartalmaz. A kiindulási anyag kémiai kezelésével első lépcsőben keletkezett inzulinszármazékokat és vegyületeket egymástól el kell választani. Különösen nehéz ez a feladat, ha bázikus jellegű inzulinszármazékokat kell szétválasztani. amelyek a tercier-szerkezet képződése után a molekulán belül lévő aminosavakon derivatizálódást mutatnak. Erre vonatkozólag egy összehasonlító kísérlet ad tájékoztatást (1. B rész): a 26 29 568 sz. német szövetségi köztársaság-beli szabadalmi leirás inzulin tisztítására vonatkozó anioncserélő eljárást ismertet, melynek során az eluáló folyadékhoz a protein-aggregáció elkerülése érdekében nemionos tenzidet adnak. Ez az eljárás jól alkalmazható inzulinok tisztításához, de ha pL géntechnikai eredetű proinzulin tripszinnel történő hasításával kapott bázikus proteinek elválasztását és elkülönítését kísérlik meg, ez nem hozza meg a kívánt eredményt, a szétválasztás nem sikerül. Ezt a megfelelő eluálási profil (1. B rész) bizonyltja; látható, hogy az egyes peptidekre vonatkozó hullámcsúcsok egymásba átmennek. Ismeretesek olyan eljárások is, amelyek segítségével az említett proinzulin hasítási termékek szétválaszthatok. - Steiner és társai a .Journ. of Bioi. Chem.' 246, 1365-1374. oldalán (1971) C-peptid elkülönítésére vonatkozó eljárásról tájékoztatnak proinzulin hasítási termékből. Ennél az eljárásnál (hozamot nem adtak meg) gyengén savanyú, karboximetilcsoportokát (CM) tartalmazó, cellulózbázisú kationcserélón kromatografálunk. A felvitelre kerülő és az eluáló oldathoz 7 mól/1 karbamidot adnak, hogy megakadályozzák a proteinek aggregációját. Ilyen nagy mennyiségű karbamid jelenléte azonban hátrányos, mert ez proteinszármazékok kialakulásához vezet, elsősorban a szabad aminocsoportok karbamoileződéséhez. Markussen és társai a .Protein Engineering* 1. köt. 3. sz. 205-213. oldalán (1987) kromatográfiás eljárást ismertetnek háromdimenziós, térhálósított poliszacharid mátrix alapú, dietil-2-hidroxi-propil-amino-etíl-tartalmú (QAE) anioncserélőn. - Ennél az eljárásnál - az anioncserélós kromatográfia hozamát nem adták meg - a proteinek aggregációjának meggátlására 60%-os etanol-oldatban dolgoznak. A koncentrált etanol-oldatok alkalmazásának az a hátránya, hogy a koncentrált szerves oldószerekkel kapcsolatban szükséges technikai, biztonsági előírásokat kell követni. Másfelől pedig az említett alkohol-koncentrációnál a proteinek denaturálódása lép fel. A fentiek ismeretében azt a feladatot tűztük ki, hogy megfelelő szétválasztási és elkülönítési eljárást dolgozunk ki bázikus proteinek előállításához proteinkeverékekből. Azt tapasztaltuk, hogy ha a proteinkeverékeket erősen savas kationcserélón kromatografáljuk és az eluáláshoz viszonylag kis mennyiségű alkoholt használunk, a technika állásához képest egyrészt a szétválasztás kedvezőbb eredményt ad, másrészt a proteinek átalakulása is messzemenően elkerülhető. Figyelemreméltó, hogy olyan származékok is elválaszthatók, amelyek - a proinzulin előkezelésénél keletkező - változást mutatnak a szóbanlevő proteinek tercier-szerkezetében. A szétválasztott proteinek aggregációjára nem került sor. Az ioncserélő ismételt alkalmazása semmiféle nehézséget nem okoz. A találmány tárgya tehát eljárás bázikus proteinek elkülönítésére proinzulin és/vagy ennek természetes, félszintetíkus vagy géntechnikai eredetű származékai enzimatikus hatásával kapott proteinkeverékekból, melynek során a proteinkeveréket ioncserélőre visszük fel és eluáljuk. Találmányunkat az jellemzi, hogy ioncserélőként erősen savas kationcserélöt alkalmazunk és az eluáláshoz viz és 1-4 szénatomos alkanol keverékét használjuk, a keverék kb. 10-50 térfogatX, előnyösen kb. 20-40 térfogatX, különösen 30 térfogatX alkanolt tartalmaz. A találmány szerinti eljárással nagy hozammal lehet bázikus proteineket elkülöníteni tetszés szerinti proinzulinok illetve ezek származékai, mint pl. majom-pre-proinzulin hasítási keverékeiből. Ioncserélőként elvben valamennyi erősen savas kationcserélő szóba jöhet. Előnyösek 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
