198218. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bázikus proteinek izolálására protein-elegyekből
3 HU 198218 B azok az erősen savas kationcserélőki melyek funkciós csoportként szulfocsoportot, különösen szulfo-propilcsoportot (-CHz-CHí-CH2- -SO3H) tartalmaznak, pl. hidrofil, hidroxicsoportot tartalmazó vinilpolimer (pl. (B)Fractogel TSK, gyártó cég Merck, Darmstadt), akril-kopolimer (pl. SP Trisacryl M, gyártó cég Réactifs IBF, Villeneuve-la-Gavenne, Franciaország) mátrixon vagy térhálós agaróz részt tartalmazó géleken (pl. S-ís) Sepharose, gyártó cég Pharmacia, Upsala, Svédország); különösen előnyös az S-Sepharose. Közvetlenül a hasitási keverék felvitele előtt az erősen savas kationcserélőhöz pufferolda'tot kell adni. A pufferoldat előnyösen viz ób 1-4 szénatomos alkohol keveréke, melyben az alkohol mennyisége előnyösen kb. 10-50 térfogat*, célszerűen kb. 20-40 térfogat*, különösen kb. 30 térfogat*. Előnyben részesülnek az etanol és az izopropanol, különösen az izopropanol. A pufferoldathoz további adalékanyagok adhatók, pl. só, előnyösen fiziológiásán elviselhető ásványi sók, egy vagy több tetszés szerinti szerves sav, előnyösen tejsav, valamilyen bázis, előnyösen NaOH, és/vagy konzerváló anyagok. A pufferoldat előnyős pH-értéke kb. 2,5-5,5 között, különösen kb. 3,5-4,0 között van. Az erősen savas kationcserélőre való felvitelhez a hasitási keveréket egy pufferoldatban - előnyösen az előbbiekben leirt őszszetételben és a megadott pH értéken - oldjuk és az Így kapott oldatot az erősen savas kationcserélővel érintkezésbe hozzuk. Az eluáló oldat - melynek lényegében az előbb leírt pufferoldattal azonos összetétele van - pH-értéke előnyösen 3,5-4,0 között van. Különösen olyan elúciós eljárás minősül előnyösnek, melynél az eluáló oldat előnyösen lineáris felfutású sókoncentráció-gradienst mutat. Ez a koncentráció-gradiens például úgy hozható létre, hogy az eluálás kezdetén az eluáló oldat sókoncentrációja csekély (határesetben közel 0) és az eluciós folyamat során a sókoncentrációt növeljük. Ezen a módon a proteinkeveréket különösen hatékonyan lehet szétválasztani. Az előnyös sókoncentrációgradiens a közel 0 mól só/l (az eluálás kezdete) és a kb. 1 mól só/l (az eluálás vége, között váltakozhat, különösen előnyös a kb. 0,15 (az eluálás kezdete) és a 0,35 mól/1 (az eluálÓB vége) közötti érték. Sóadalékként számos szerves és szervetlen só jöhet számításba. Előnyösek a fiziológiásán elviselhető sók, mint az ammonium- és alkáli-sók, célszerűen nátrium-sók, különösen a nátrium-klorid. A találmány szerinti szétválasztási eljárást különböző módon, előnyösen oszlopon vagy szakaszosan valósíthatjuk meg. A hőmérsékletet - amelyet az ioncserélö-kromatográfiában előnyösen konstants értéken kell tartani - széles körben variálhatjuk. Előnyös a kb. -10 °C-50 °C közötti, különösen a 15- -20 °C közötti hőmérséklet-intervallum. Az alábbi kiviteli példában (A) a találmányt közelebbről mutatjuk be. Az utána következő ősBzehasonlitó példával (B) a találmány szerinti eljárás előnyeit kívánjuk bizonyítani a technika állásához tartozó (26 29 568 sz. NSZK-beli szabadalmi leírás), inzulin tisztítására vonatkozó eljárással szemben. A) példa a találmány szerinti eljáráshoz 50 mmól/1 tejsavat, 30 tömeg* izopropanolt és 1 raól/1 nátriura-kloridot tartalmazó kb. 3,5 pH-értékű vizes pufferoldatban 6 1 S-Sepharose-t feliszapolunk és kb. 80 cm magasságban 10 cm átmérőjű oszlopba töltünk. Az oszlopot 10 1 vizes start-pufferoldattal (50 mmól/1 tejsav, 30 tömeg* izopropanol, 0,15 mmól/1 nátrium-klorid, pH-érték kb. 3,5) tartjuk egyensúlyban. Pre-prohumáninzulin tripszinnel végrehajtott hasításából származó, 6,2 g inzulin-Arg-B31-32-t, 3 g inzulin-Arg-B31-t és inzulin-Des-Thr-B30-t, valamint ismeretlen hasítási intermediereket és származékokat tartalmazó kristályos hasitási keverékből 15 g-t 3 1 start-pufferben oldunk és az oszlopra felvisszük. Utána 50 mmól/1 tejsavat és 30 tömeg* izopropanolt tartalmazó, 3,5 pH-értéken (NaOH-val beállított) vizes oldattal és 0,15 mól/1-0,35 mól/1 gradiensű nátrium-koriddal eluáljuk. Az eluáló oldat tömege 2 x 20 1. Az átfolyási sebesség 1,5 1/óra. Azokat a frakciókat, melyek inzulin-Arg-B31-32 tartalma HPLC (High Pressure Liquid Chromatography = nagynyomású folyadék-kromatográfia) szerint 90* fölött van, összegyűjtjük, 1:1 arányban vízzel hígítjuk, majd 10 ml lOX-os ZnCLr-oldat/l oldat hozzáadásával és a pH 6,8-ra való beállításával kicsapjuk. A hozam 5 g inzulin-Arg-B31-32, ami az inzulin-Arg-B31-32-re vonatkoztatva 80* oszlophozamnak felel meg. B) összehasonlító példák Az I összehasonlító példát a 26 29 568 sz. NSZK-beli szabadalmi leírás, és a II példát a találmány szerint hajtottuk végre. Az 1. táblázatban az eljárási paramétereket és az elért eredményeket állítottuk egymással szembe. Az 1. ábra az I összehasonlító példánál, a 2. ábra a II, a találmány szerinti eljárásnál felvett elúciós profilt mutatja. Az A abszorpciót az UV-tartományban 278 nm hullámhosszúságnál (Ans), szemben az elúciós idővel illetve a frakciók számával vittük feL Az elúciós profilok mutatják, hogy a találmány szerint jobban szétválaszthatók a bázikus proteinek, mint a 26 29 568 sz. NSZK-beli szabadalmi leírásban ismertetett eljárással. Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárás nagyobb hozamot és a termék nagyobb tisztaságát is eredményezi (L 1. táblázat). 5 1Ó 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
