198184. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-hidroxi-nikotinsav előállítására biotechnológiai úton
3 HU 198184 B 4 lás után közvetlenül, vagyis enzimkinyerés vagy tisztítás nélkül felhasználható a nikotinsav hidroxilezéséhez. A nikotinsav hidroxilezés érdekében célszerű, ha a nikotinsav leépítését nem az első lépéssel, vagyis nem a 6-hidroxi-nikotinsavvá történő hidroxilezéssel indítjuk. Ebben a fázisban a mikroorganizmus fejlődése a kitermelés rovására növekszik. A nikotinsav gazdaságos hidroxilezéséhez az alábbi paramétereket kell kielégíteni: a) a sejteket ne hagyjuk túlfejlődni (nikotinsav-felhasználás); b) a nikotinsav-hidroxiláz maradjon aktív; c) a nikotinsav lebontását a 6-hidroxi-nikotinsavnál meg kell szakítani; d) a terméket (6-hidroxi-nikotinsav) a sejtektől el kell választani. Meglepő módon azt találtuk, hogy ezek a paraméterek egyidejűleg kielégíthetők, ha megemeljük a nikotinsav koncentrációját. Úgy tűnik, hogy a 6-hidroxi-nikotinsav előállítására szolgáló fenti gazdaságos eljárás a mikrobiológiai metabolizmusban széles körben elterjedt. Feltehető, hogy a következő enzimet (6-hidroxi-nikotinsav-hidroxiláz) gátolja a túl nagy nikotinsav-koncentráció. Mint említettük, a DSM 2783 törzs hígított nikotinsav oldatban (0,05-0,5 tömeg%) jól fejlődik, és a nikotinsavat teljes mennyiségben felhasználja. A nikotinsav növekvő koncentrációja azonban gátolja a sejt növekedését és a 2-tömeg% nikotinsav koncentráció felett további fejlődés nem figyelhető meg. A nikotinsav-hidroxiláz aktivitása a sejten belül változatlan marad. Az enzimatikus hidroxilezés reakciója előnyösen 20-40 °C közötti hőmérsékleten és pH = 5,5-9,0 között játszódik le aerob körülmények között. Célszerűen 0,1 tömeg% és telítettség közötti koncentrációjú, előnyösen 0,5-10 tömeg%-os nikotinsav oldatot alkalmazunk. A nikotinsav felhasználható alkálisó oldat formájában is. A katabolitikus leépítés a hidroxilező lépés után megszakad. Ez kiküszöböli a mellékreakciókat és növeli a 6-hidroxi-nikotinsav tisztaságát és kitermelését. A vizsgált mikroorganizmusok további előnyős tulajdonsága, hogy a hidroxilezés végtermékét, a 6-hidroxi-nikotinsavat oldatban választják le. Ez lényegesen leegyszerűsíti a termék izolálását. Miután a sejteket centrifugálással vagy mikroszűréssel eltávolitottuk a reakcióelegyből, a tiszta oldatot megsavanyítjuk. A kiváló fehér 6-hidroxi-nikotinsavat szűrjük és szárítjuk. Gyakorlati okokból a példákban a 6-hidroxi-nikotinsav laborméretű előállítását 2 lépésre osztottuk: 1. lépés: nagy nikotinsav-hidroxiláz-aktivitással rendelkező biomassza elóállitása; 2. lépés: a nikotinsav enzimatikus hidroxilezése. A két lépés természetesen egylépcsős eljárássá is kombinálható. 1. példa Achromobacter xylosoxyda ns DSM 2783 előállítása (1. lépés) 51,9 g Na2HP04-2Hz0, 20,0 g KH2PO4, 2.5 g élesztókivonnt és 10 g nikotinsav keverékéből, valamint 4750 ml vizből álló tápoldatot töltünk a fermentorta, és 20 percen keresztül 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. Ez után 30 °C hőmérsékletre hűtjük, hozzáadjuk a fent ismertetett nyomelemek steril oldatát és 500 ml inditókultúrával (azonos összetétel) beoltjuk. A fermentálást 30 °C hőmérsékleten pH = 7,0 érték mellett levegőztetés közben 24 órán keresztül végezzük. Ez után 200 ml steril oldatot adunk hozzá, amely vízben oldva 10 g nikotinsavat és 2.5 g élesztókivonatot tartalmaz. A fermentációt 42 órán keresztül folytatjuk. Ezután a kultúrát begyűjtjük és az Achromobacter sejteket centrifugálással (30 perc 15000 g mellett) elválasztjuk. Ily módon 38,3 nedves biomasszát kapunk. A nikotinsav hidroxilezése (2. lépés) Egy 3 literes fermentorba 2250 ml 5 tömeg%-os nátrium-nikotinét oldatot töltünk (pH = 6,5) és 30 °C hőmérsékletre melegítjük. Hozzáadjuk az Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 sejtek 120 ml vízben felvett szuszpenzióját és az elegyet intenzív kevertetés közben levegőztetjük. A reakcióelegyben a pH, a hőmérséklet és az oxigén koncentráció értékét folyamatosan mérjük és szabályozzuk (pH = 7,0; T = = 30 °C; p02 = 5,5 mg/1). 7 óra múlva az oldott oxigén koncentrációja megemelkedik (p02 = 7,5 mg/1), ami a reakció befejeződését jelenti. A reakcióelegyet lecentrifugáljuk, és a sejteket a következő reakcióhoz félreteszszük. A tiszta felső részt koncentrált kénsavval pH = 1,5-re állítjuk, a kivált 6-hidroxi-nikotinsavat leszívatjuk és szárítjuk. Ily módon 121 g fehér terméket kapunk, amely HPLC-analizis alapján 98,6% 6-hidroxinikotinsavat tartalmaz. A felhasznált nikotinsav mennyiségére vonatkoztatott kitermelés értéke 93,7%. 2. példa Pseudomonas putida ArCiB S0 521 sejtek előállítása (1. lépés) 1 liter 1. példa szerinl.i tápoldatot 2 literes lombikban sterilizálunk, majd 30 °C hőmérsékletre történő lehűlés után agar-lemezról származó Pseudomonas NCIB 10 521 kul-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
